Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) die brede belangstelling heeft getrokken voor het detectieveld van ziekteverwekkers. Hier presenteren we een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol als een snelle, betrouwbare en robuuste methode voor het screenen van Salmonella in dierlijk voedsel en het bevestigen van vermoedelijke Salmonella uit cultuurisolatie.
Lusgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is naar voren gekomen als een krachtige nucleïnezuurversterkingstest voor de snelle detectie van tal van bacteriële, schimmel-, parasitaire en virale middelen. Salmonella is een bacteriële ziekteverwekker van wereldwijd voedselveiligheidsprobleem, inclusief voedsel voor dieren. Hier wordt een multilaboratorium gevalideerd Salmonella LAMP-protocol gepresenteerd dat kan worden gebruikt om diervoeding snel te screenen op de aanwezigheid van Salmonella-besmetting en kan ook worden gebruikt om vermoedelijke Salmonella-isolaten te bevestigen die uit alle voedselcategorieën zijn teruggewonnen. De LAMP-test richt zich specifiek op het Salmonella-invasiegen (invA) en is snel, gevoelig en zeer specifiek. Template DNAs worden bereid uit verrijkingsbouillons van dierlijk voedsel of pure culturen van vermoedelijke Salmonella-isolaten. Het LAMP-reagensmengsel wordt bereid door een isothermische hoofdmix, primers, DNA-sjabloon en water te combineren. De LAMP-test wordt gedurende 30 minuten uitgevoerd bij een constante temperatuur van 65 °C. Positieve resultaten worden gecontroleerd via real-time fluorescentie en kunnen al vanaf 5 minuten worden gedetecteerd. De LAMP-test vertoont een hoge tolerantie voor remmers in dierlijk voedsel of kweekmedium en dient als een snelle, betrouwbare, robuuste, kosteneffectieve en gebruiksvriendelijke methode voor het screenen en bevestigen van Salmonella. De LAMP-methode is onlangs opgenomen in het Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 van de Amerikaanse Food and Drug Administration.
Loopgemedieerde isothermale versterking (LAMP) is een nieuwe isothermische nucleïnezuurversterkingstest (iNAAT) uitgevonden in 2000 door een groep Japanse wetenschappers1. Door de vorming van een doelspecifieke stamlus-DNA-structuur tijdens de eerste stappen, gebruikt LAMP een strengverdringende DNA-polymerase om dit uitgangsmateriaal quasi-exponentieel efficiënt te versterken, wat resulteert in 109 kopieën van het doel in minder dan 1 h1. In vergelijking met polymerasekettingreactie (PCR), een veelgebruikte NAAT, heeft LAMP verschillende voordelen. Ten eerste worden LAMP-reacties uitgevoerd onder isothermale omstandigheden. Dit verdoezelen de noodzaak van een geavanceerd thermisch fietsinstrument. Ten tweede is LAMP zeer tolerant ten opzichte van kweekmedia en biologische stoffen2 met robuustheid die is aangetoond voor zowel klinische als voedseltoepassingen3,4. Dit vereenvoudigt de monstervoorbereiding en minimaliseert valse negatieve resultaten5. Ten derde is LAMP vatbaar voor meerdere detectieplatforms, zoals troebelheid, colorimetrie, bioluminescentie, fluorescentie en microfluïdica6. Ten vierde is LAMP zeer specifiek omdat het vier tot zes speciaal ontworpen primers gebruikt om zich te richten op zes tot acht specifieke regio ‘s1,7. Ten vijfde, LAMP is ultragevoelig en talrijke studies hebben gemeld zijn superieure gevoeligheid voor PCR of real-time PCR8. Ten slotte is LAMP sneller met veel tests die nu een standaardlooptijd van 30 minuten aannemen, terwijl PCR-achtige tests meestal 1−2 uur8nemen.
Deze aantrekkelijke kenmerken voedden de toepassing van LAMP in brede pathogene detectiegebieden, met inbegrip van in vitro diagnostiek 9, dierziektediagnostiek10, en voedsel – en milieutests11. Met name een TB-LAMP (LAMP voor Mycobacterium tuberculosis) is door de WHO aanbevolen als een geldige vervangingstest voor sputum-smear microscopie voor longtuberculosediagnoses in perifere omgevingen12. Lamp-toepassing breidt zich ook verder uit dan microbiële identificatie met de detectie van allergenen, diersoorten, medicijnresistentie, genetisch gemodificeerde organismen en pesticiden13.
Niet-tyfus salmonella is een zoönotische ziekteverwekker van aanzienlijke voedselveiligheid en volksgezondheidszorg wereldwijd14. Het is ook geïdentificeerd als een belangrijk microbieel gevaar in levensmiddelen voor dieren (d.w.z. dierlijk voedsel)15,16. Om salmonellaziekten/uitbraken door besmet menselijk voedsel en dierlijk voedsel te voorkomen, is het absoluut noodzakelijk om snelle, betrouwbare en robuuste methoden te hebben om Salmonella in verschillende matrices te testen. In het afgelopen decennium zijn internationaal aanzienlijke inspanningen geleverd voor de ontwikkeling en toepassing van Salmonella LAMP-tests in een breed scala aan voedselmatrices, zoals onlangs samengevat in een uitgebreide review8. Verschillende Salmonella LAMP-tests, waaronder de hier gepresenteerde, hebben met succes multilaboratoriumvalidatie voltooid volgens de gevestigde internationale richtlijnen17,18,19,20.
Onze Salmonella LAMP-test richt zich specifiek op het Salmonella-invasiegen invA (GenBank-toetredingsnummer M90846)21 en is snel, betrouwbaar en robuust in meerdere voedselmatrices4,22,23,24,25,26. De methode is gevalideerd in zes dierlijke voedselmatrices in een precollaboratieve studie26 en in droog hondenvoer in een samenwerkingsstudie met meerderelaboratoria 19. Als gevolg hiervan is de hier gepresenteerde Salmonella LAMP-methode onlangs opgenomen in het Bacteriological Analytical Manual (BAM) Chapter 5 Salmonella27 van de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA) om twee doelen te dienen, een als een snelle screeningmethode voor de aanwezigheid van Salmonella in dierlijk voedsel en twee als een betrouwbare bevestigingsmethode voor vermoedelijke Salmonella geïsoleerd van alle voedingsmiddelen.
We hebben hier een eenvoudige, snelle, specifieke en gevoelige LAMP-methode gepresenteerd voor het screenen en bevestigen van Salmonella in respectievelijk dierlijk voedsel en pure cultuur. Met het gemak van een isothermische hoofdmix die vier belangrijke reagentia bevat, en een kant-en-klare, in-house bereide primermix, vereist het monteren van een LAMP-reactie slechts een paar pipettingstappen (figuur 1). De totale looptijd inclusief versterkings- en gloeifasen is minder dan 38 min (figuur 2A,B pt figuur 3A,B). Positieve resultaten worden gecontroleerd via real-time fluorescentie(figuur 2C pt figuur 3C,D) en kunnen al worden gedetecteerd vanaf 5 min26. De gloeifase dient als een extra bevestiging van de specificiteit van de LAMP, aangezien alleen monsters met de juiste Tm (ongeveer 90 °C) als positief worden gerapporteerd (figuur 2D,E pt figuur 3E−G). Gevoeligheden van 1 Salmonellacel in zuivere cultuur en < 1 KVE/25 g in dierlijk voedsel zijn eerder gemeld26.
Omdat LAMP vrij effectief is en een grote hoeveelheid DNA1genereert, is het van cruciaal belang dat de beste laboratoriumpraktijken worden gebruikt om kruisbesmetting te voorkomen, waaronder het fysiek scheiden van de gebieden voor het bereiden van de LAMP-hoofdmix en het toevoegen van DNA-sjablonen, het vermijden van het genereren van aerosolen, het gebruik van filterpipetpunten, het vaak wisselen van handschoenen en het onthouden van het openen van LAMP-reactiebuizen na versterking.
De specificiteit van deze Salmonella LAMP-methode werd eerder getest met behulp van 300 bacteriestammen (247 Salmonella van 185 serovars en 53niet-Salmonella) en bleek 100% specifiek te zijn26. Met name werden significante verschillen in Tmax waargenomen tussen de twee Salmonella-soorten, S. enterica pt Salmonella bongori, en tussen S. enterica-ondersoorten, met name subsp. arizonae (IIIa)26. Niettemin waren dit nog steeds geldige positieve resultaten volgens de regels voor de interpretatie van LAMP-resultaten. In onze multilaboratorium samenwerkingsstudie in droog hondenvoer waarbij 14 analisten19betrokken waren, werden af en toe monsters waargenomen met inconsistente resultaten in dubbele LAMP-runs. Het ging meestal om monsters met vertraagde positieve resultaten(Tmax > 15 min). Als u beide uitvoeringen onafhankelijk herhaalt, is het probleem meestal opgelost. Meer zelden observeerden we monsters met de juiste Tm maar geen of onregelmatige Tmax waarden (< 5 min). Dit werd meestal veroorzaakt door luchtbellen in de reactiebuis.
Gedurende de levenscyclus van lamp methode ontwikkeling, evaluatie, precollaboratieve studie, en multi-laboratorium validatie, hebben we waargenomen hoge tolerantie van LAMP voor remmers in verschillende dierlijke voedsel of voedsel matrices en cultuur media4,19,22,23,24,het benadrukken van de robuustheid van de methode en het samenwerken van tal van andere studies op een wereldwijde schaal8. Dit is superieur in vergelijking met PCR of real-time PCR, die meestal een interne versterkingscontrole vereist om ervoor te zorgen dat negatieve resultaten niet te wijten zijn aan matrixremming28. Voorts vertoonde LAMP in de overgrote meerderheid van de studies een vergelijkbare (of superieure) specificiteit en gevoeligheid in vergelijking met PCR of real-time PCR8. De kosten van LAMP-reagentia bedragen ongeveer $ 1 per reactie. De LAMP-instrumenten die in dit protocol worden gebruikt, zijn klein, onderhoudsarm en draagbaar. Ze kunnen omgaan met elke isothermale versterkingsmethode die doeldetectie gebruikt door fluorescentiemeting, inclusief LAMP. Met behulp van de LAMP-software kunnen uitgebreide rapporten in meerdere formaten worden gegenereerd (pdf, tekst en afbeelding).
Methodevalidatie is een kritieke stap voordat een nieuwe methode kan worden gebruikt voor routinematig gebruik. Het is opmerkelijk dat het hier gerapporteerde LAMP-protocol de validatie met meerdere laboratoria met succes heeft voltooid19. Met de recente opname van dit LAMP-protocol in bam hoofdstuk 5 Salmonella27van de Amerikaanse FDA , wordt verwacht dat de methode veel breder zal worden gebruikt, zowel als een snelle screeningmethode in diervoeding als als een betrouwbare bevestigingsmethode voor vermoedelijke Salmonella-isolaten uit alle voedselcategorieën.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken leden van de FDA’s Microbiology Methods Validation Subcommittee (MMVS) en Bacteriological Analytical Manual (BAM) Council voor het kritisch beoordelen van Salmonella LAMP-methodevalidatiestudies.
Brain heart infusion (BHI) broth | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 299070 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Buffered peptone water (BPW) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218105 | Preenrichment medium for the recovery of Salmonella from animal food samples. |
DNA AWAY | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 7010 | Eliminates unwanted DNA and DNase from laboratory bench, glassware, and plasticware without affecting subsequent DNA samples. |
Genie Explorer software | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | Version 2.0.6.3 | Supports remote operation of Genie instruments including LAMP runs and data analysis. |
Genie II or Genie III (LAMP instrument) | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GEN2-02 or GEN3-02 | A small instrument capable of temperature control up to 100 °C with ± 0.1 °C accuracy and simultaneous fluorescence detection via the FAM channel. Genie II has 2 blocks (A and B) with 8 samples in each block. Genie III has a single block that accommodates 8 samples. |
Genie strip | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | OP-0008 | 8-well microtube strips with integral locking caps and a working volume of 10 to 150 µl. |
Genie strip holder | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | GBLOCK | Used to hold Genie strips when setting up a LAMP reaction, the aluminum holder can also be used as a cool block. |
Hydrochloric acid (HCl) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SA48-500 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Heat block | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 88-860-022 | Heats samples at 100 ± 1 oC for DNA extraction. |
Incubator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 3960 | Standard laboratory incubator. |
ISO-001 isothermal master mix | OptiGene Ltd., West Sussex, United Kingdom | ISO-001 | An optimized master mix to simplify the assembly of a LAMP reaction, containing a strand-displacing GspSSD DNA polymerase large fragment from Geobacillus spp., thermostable inorganic pyrophosphatase, reaction buffer, MgSO4, dNTPs, and a double-stranded DNA binding dye (FAM detection channel). |
Isopropanol | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | A416 | Disinfects work surfaces. |
LAMP primers | Integrated DNA Technologies Inc., Coralville, IA | Custom | LAMP primers with detailed information in Table 1. |
Microcentrifuge | Eppendorf North America, Hauppauge, NY | 22620207 | MiniSpin plus personal microcentrifuge. |
Microcentrifuge tubes | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 05-408-129 | Standard microcentrifuge tubes. |
Molecular grade water | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | AM9938 | Used in making primer stocks, primer mix, and LAMP reaction mix. |
Sodium hydroxide (NaOH) solution, 1 N | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | SS266-1 | Adjusts pH of animal food samples after adding BPW and prior to overnight enrichment. |
Nonselective agar (e.g., blood agar, nutrient agar, and trypticase soy agar) | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | R01202 | Solid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Peptone water | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 218071 | Dilutes overnight Salmonella cultures to make positive control DNA. |
Pipettes and tips | Mettler-Toledo Rainin LLC, Oakland CA | Pipet Lite LTS series | Standard laboratory pipettes and tips. |
PrepMan Ultra sample preparation reagent | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA | 4318930 | A simple kit used for the rapid preparation of DNA templates for use in a LAMP reaction. |
Salmonella reference strain LT2 | ATCC, Manassas, VA | 700720 | Salmonella reference strain used as positive control. |
Trypticase soy broth (TSB) | BD Diagnostic Systems, Sparks, MD | 211768 | Liquid growth medium used in the cultivation of Salmonella. |
Vortex mixer | Scientific Industries, Inc., Bohemia, NY | SI-0236 | Standard laboratory vortex mixer. |
Whirl-pak filter bag | Nasco Sampling Brand, Fort Atkinson, WI | B01318 | Filter bags to hold animal food samples for preenrichment. |