Изоляция и культура первичных нейронов и Глиа от взрослых Крыса мочевого пузыря
Summary
Этот протокол пытается установить повторяемый протокол для первичных нейронов и глиа изоляции от крысиного пузыря для дальнейших клеточных экспериментов.
Abstract
Нижний мочевыводящих путей имеет две основные функции, а именно, периодическое хранение мочи и micturition; эти функции опосредовано через центральную и периферическую нейрорегуляцию. Хотя обширные исследования на нижней мочевыводящих путей нервной системы была проведена, большинство исследований были сосредоточены на первичной культуры. Этот протокол вводит метод изоляции и культуры нейронов мочевого пузыря и глии от крыс Спраг-Доули. В этом методе, нейроны и глии были инкубированы в 37 градусов по Цельсию, 5% CO2 инкубатор в течение 5-7 дней. В результате они переросли в зрелые формы, пригодные для последующих экспериментов по иммунофлюоресценции. Клетки морфологически наблюдались с помощью оптического микроскопа. Нейроны, синаптические пузырьки и глиа были выявлены β-III-тубулином и MAP-2, Синапсин-1 и GFAP окрашивание, соответственно. Между тем, иммуноцитохимия была выполнена на нескольких нейромедиатора связанных белков, таких как холин ацетилтрансферазы, DYNLL2, и SLC17A9.
Introduction
Нижний мочевыводящих путей имеет две основные функции: периодическое хранение мочи и micturition1. Нижняя мочевыводящих путей нервной системы (LUTNS) контролирует эти функции и деликатный и восприимчивы ко многим невропатии, которые могут быть врожденными (порфирия), приобретенные (болезнь Лайма), вторичные состояния болезни (диабетическая цистопатия), препарат индуцированной (геморрагический цистит), вызванные (абдоминоперинальной ресекции),илитравмы,вызванные (травматическая травма спинного мозга)2, 3 , 5 , 5,5. В физиологических/патологических исследованиях не менее важны эксперименты in vivo и in vitro. В то время как in vivo исследования lutNS были проведены на уровне органов, клеток и молекулярных в течение некоторого времени, в пробирке исследования первичных нейронов из мочевогопузыря почти не существует 8,9. Хотя настоящее исследование ограничено, мы надеемся, что пионер исследований в этой области, с тем чтобы другие исследователи могли улучшить его. Таким образом, эта ко-культура может привести к клеточному пониманию физиологической дисфункции в фенотипах, таких как дисфункция нейронов мочевого пузыря.
В отличие от энтерических мышц с четкой направленностью мышечных клеток в дискретные слои, мышцы мочевого пузыря неорганизованы10. Поэтому вместо того, чтобы отслаиваться от внешнего слоя мочевого пузыря, этот метод предлагает переваривать весь мочевой пузырь, чтобы уменьшить сложность работы и сократить время предварительной обработки для высокой выживаемости клеток.
Следуя этому методу, мы можем получить смешанную культуру нейронов и других клеток. Другие клетки незаменимы, потому что их присутствие имитирует среду in vivo11. Кроме того, такие клетки обеспечивают вещества, которые отсутствуют в среде.
Этот метод включает в себя два шага для пищеварения. Во-первых, коллагеназа типа II используется для гидролизового коллагена, а затем трипсина, чтобы разобщить ткани в клетки10. Таким образом, ткани мочевого пузыря рассредоточены по одиночным клеткам, а затем становятся относительно независимыми. Когда культура нейронов созревает, нейроны могут быть использованы для визуализации или функциональных анализов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Подготовка плиты
Использование стеклянных крышки в 6-, 12-, или 48-хорошо культуры пластин для иммунофлуоресцентных или кальция изображений экспериментов является экономичным и образца щадящей операции. Клетки хорошо растут в пластинах без крышки во время подготовки первичны?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Национальным фондом естественных наук Китая (Grant No 81673676) и Бюро науки и технологий Дунгуаня (Grant No 201962101002). Авторы благодарят доктора Мэрироуз Салливан (помощник профессора хирургии Гарвардской медицинской школы) за техническое консультирование.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibico | 15050065 | Enzyme digestion |
| 48-well culture plate | Corning | 3548 | Coating dish |
| antibiotic/antimycotic | Gibico | 15240062 | Culture media/Rinse media |
| Anti-Glial Fibrillary Acidic Protein Antibody | Santa Cruz | sc-33673 | ICC |
| B-27 | Gibico | 17504044 | Culture media |
| BSA Fraction V | Gibico | 332 | Enzyme digestion |
| Choline Acetyltransferase Antibody | Abcam | ab18736 | ICC |
| CO2 Incubator | Heraeus | B16UU | Cells culture |
| Collagenase type II | Sigma | 2593923 | Enzyme digestion |
| DMEM/F-12 | Gibico | 11330032 | Rinse media |
| DYNLL2 Antibody | Santa Cruz | sc-13969 | ICC |
| Fetal Bovine Serum | Gibico | 10100147 | Culture media/Rinse media |
| Forceps | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | 1383 | 10 cm; Sterile operation |
| Glass breakers | Huan Qiu Medical Devices | 1101 | 50 ml; Sterile operation |
| Glass coverslips | WHB Scientific | WHB-48-CS | Coating dish |
| Glass dishes | Huan Qiu Medical Devices | 1177 | 100 mm; Sterile operation |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 488 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Goat Anti-Rat IgG(H+L), Mouse ads-Alexa Fluor 555 | Southernbiotech | 3050-30 | ICC |
| Hoechst 33342 | BD | 561908 | ICC |
| Laminar flow bench | Su Jie Medical Devices | CB 1400V | Sterile operation |
| Laminin | Sigma | L2020 | Coating dish |
| L-glutamine | Gibico | 25030081 | Culture media |
| MAP-2 Antibody | Affinity | AF5156 | ICC |
| Murine GDNF | Peprotech | AF45044 | Culture media |
| Neurobasal-A Medium | Gibico | 10888022 | Culture media |
| Ophthalmic scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21010 | 12.5 cm; Sterile operation |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000240 | 100-1000 ul; Reagent and sample pipetting |
| Pipettes | Eppendorf | 3120000267 | 10-100 ul; Reagent and sample pipetting |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | Coating dish |
| Refrigerated centrifuge | Ping Fan Instrument | TGL-16A | Enzyme digestion |
| Shaking incubator | Haimen Kylin-Bell Lab Instruments | T8-1 | Enzyme digestion |
| SLC17A9 Antibody | MBL International | BMP079 | ICC |
| Spoons nucleus divider | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | YZR030 | 12 cm; Sterile operation |
| Substance P Antibody | Santa Cruz | sc-58591 | ICC |
| Surgical scissors | Shanghai Jin Zhong Medical Devices | J21130 | 16 cm; Sterile operation |
| Surgical towel | Fu Kang Medical Devices | 5002 | 40 x 50 cm; Sterile operation |
| Synapsin-1 Antibody | CST | 5297T | ICC |
| Tubulin beta Antibody(β-III-tubulin) | Affinity | AF7011 | ICC |
Referências
- Fowler, C. J., Griffiths, D., de Groat, W. C. The neural control of micturition. Nature Reviews Neuroscience. 9 (6), 453-466 (2008).
- Golbidi, S., Laher, I. Bladder dysfunction in diabetes mellitus. Frontiers in Pharmacology. 1, 136 (2010).
- Iwasawa, E., et al. Long-term Effects of Intravenous Cyclophosphamide in Combination with Mesna Provided Intravenously and via Bladder Perfusion in a Patient with Severe Multifocal Motor Neuropathy. Internal Medicine. 56 (14), 1893-1896 (2017).
- Lange, M. M., van de Velde, C. J. Urinary and sexual dysfunction after rectal cancer treatment. Nature Reviews. Urology. 8 (1), 51-57 (2011).
- Lin, C. S., et al. Nerve function and dysfunction in acute intermittent porphyria. Brain. 131, 2510-2519 (2008).
- Rantell, A., et al. What is the utility of urodynamics, including ambulatory, and 24 h monitoring, in predicting upper urinary tract damage in neuro-urological patients and other lower urinary tract dysfunction? ICI-RS 2017. Neurourology and Urodynamics. 37, 25-31 (2018).
- Halperin, J. J. Diagnosis and management of Lyme neuroborreliosis. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 16 (1), 5-11 (2018).
- Walter, M., et al. Reliability of supraspinal correlates to lower urinary tract stimulation in healthy participants – A fMRI study. Neuroimage. 191, 481-492 (2019).
- Leitner, L., et al. A novel infusion-drainage device to assess lower urinary tract function in neuro-imaging. BJU International. 119 (2), 305-316 (2017).
- Smith, T. H., Ngwainmbi, J., Grider, J. R., Dewey, W. L., Akbarali, H. I. An in-vitro preparation of isolated enteric neurons and glia from the myenteric plexus of the adult mouse. Journal of Visualized Experiments. (78), e50688 (2013).
- Gordon, J., Amini, S., White, M. K. General overview of neuronal cell culture. Methods in Molecular Biology. 1078, 1-8 (2013).
- Roppongi, R. T., Champagne-Jorgensen, K. P., Siddiqui, T. J. Low-Density Primary Hippocampal Neuron Culture. Journal of Visualized Experiments. (122), e55000 (2017).
- Arms, L., Vizzard, M. A. Neuropeptides in lower urinary tract function. Handbook of Experimental Pharmacology. (202), 395-423 (2011).
- Moriyama, Y., Hiasa, M., Sakamoto, S., Omote, H., Nomura, M. Vesicular nucleotide transporter (VNUT): appearance of an actress on the stage of purinergic signaling. Purinergic Signal. 13 (3), 387-404 (2017).
- Chaudhury, A., He, X. D., Goyal, R. K. Myosin Va plays a key role in nitrergic neurotransmission by transporting nNOSα to enteric varicosity membrane. American journal of physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 301 (3), 498-507 (2011).
- Le Berre-Scoul, C., et al. A novel enteric neuron-glia coculture system reveals the role of glia in neuronal development. The Journal of Physiology. 595 (2), 583-598 (2017).
- Hayashi, H., Yamada, M., Kumai, J., Takagi, N., Nomizu, M. Biological activities of laminin-111-derived peptide-chitosan matrices in a primary culture of rat cortical neurons. Archives of Biochemistry and Biophysics. 648, 53-59 (2018).
- Bottenstein, J. E., Sato, G. H. Growth of a rat neuroblastoma cell line in serum-free supplemented medium. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (1), 514-517 (1979).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized Survival of Hippocampal Neurons in B27-Supplemented Neurobasalm, a New Serum-free Medium Combination. Journal of Neuroscience Research. 35 (5), 567-576 (1993).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nature Protocols. 1 (5), 2406-2415 (2006).
- Georgas, K. M., et al. An illustrated anatomical ontology of the developing mouse lower urogenital tract. Development. 142 (10), 1893-1908 (2015).
- Adam, M., Potter, A. S., Potter, S. S. Psychrophilic proteases dramatically reduce single-cell RNA-seq artifacts: a molecular atlas of kidney development. Development. 144 (19), 3625-3632 (2017).
