Здесь представлен чувствительный флуоресцентный анализ для мониторинга активности аполипопротеина N-ацилтрансферазы с использованием диацилглицерилпептида и алкин-фосфолипидов в качестве субстратов с клик-химией.
Липопротеины из протеобактерий посттрансляционно модифицируются жирными кислотами, полученными из мембранных фосфолипидов под действием трех интегральных мембранных ферментов, в результате чего образуются триацилированные белки. Первый этап в пути модификации липопротеинов включает перенос диацилглицерильной группы из фосфатидилглицерина в пролипопротеин, что приводит к диацилглицериловому пролипопротеину. На второй стадии сигнальный пептид пролипопротеина расщепляется, образуя аполипопротеин, который в свою очередь модифицируется третьей жирной кислотой, полученной из фосфолипида. Эта последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt). Путь модификации липопротеинов имеет важное значение в большинстве γ-протеобактерий, что делает его потенциальной мишенью для разработки новых антибактериальных агентов. Здесь описан чувствительный анализ для Lnt, который совместим с высокопроизводительным скринингом малых ингибирующих молекул. Фермент и субстраты представляют собой мембранно-внедренные молекулы; поэтому разработка теста in vitro не является простой. Это включает в себя очистку активного фермента в присутствии моющего средства, наличие алкин-фосфолипидов и субстратов диацилглицерильных пептидов, а также условия реакции в смешанных мицеллах. Кроме того, чтобы использовать тест активности в высокопроизводительной системе скрининга (HTS), прямое считывание реакционного продукта предпочтительнее связанных ферментативных реакций. В этом флуорометрическом ферментном анализе алкин-триацилированный пептидный продукт становится флуоресцентным посредством реакции щелчка-химии и обнаруживается в формате многоязычной пластины. Этот способ применим к другим ацилтрансферазам, в которых используются субстраты, содержащие жирные кислоты, включая фосфолипиды и ацил-КоА.
Бактериальные липопротеины характеризуются ковалентно связанными жирными кислотами на их амино-концах, через которые они закрепляются в мембранах 1,2. Зрелая часть белка очень разнообразна по структуре и функции, тем самым объясняя роль липопротеинов в различных биологических процессах в оболочке бактериальной клетки.
Липопротеины модифицируются жирными кислотами, полученными из фосфолипидов, после введения в цитоплазматическую мембрану. Пролипопротеины содержат фирменный мотив, липобокс, который содержит инвариантный остаток цистеина, который становится ацилированным и первой аминокислотой в зрелом белке. Первая стадия этого пути катализируется пролипопротеином фосфатидилглицерином: :d яцилглицерилтрансферазой (Lgt), которая переносит диацилглицерильную группу из фосфатидилглицерина в пролипопротеин через тиоэтерную связь между диацилглицерилом и цистеином. Сигнальная пептидаза II (Lsp) расщепляет сигнальный пептид от диацилглицерильного пролипопротеина, в результате чего образуется аполипопротеин, который закрепляется в мембране через его диацилглицерильный фрагмент. Третья и последняя стадия катализируется аполипопротеином N-ацилтрансферазой (Lnt), которая добавляет жирную кислоту из положения sn-1 фосфолипида на аполипопротеин, в результате чего образуется триацилированный зрелый липопротеин (рисунок 1)3. Реакция Lnt представляет собой двухступенчатую реакцию пинг-понга, в которой образуется стабильный промежуточный продукт тиоэфирного ацилового фермента. Побочный продукт лизофосфолипида высвобождается до ацилирования аполипопротеинового субстрата на второй стадии реакции.
Специфичность фосфолипидного субстрата определяется в анализе Lnt на основе сдвига подвижности N-ацилдиацилглицерилового пептида на высоком процентном содержании Tris-Tricine Urea SDS-PAGE4. Фосфолипиды с небольшими полярными головными группами, насыщенными [sn-1] и ненасыщенными [sn-2], были предпочтительными субстратами4. Анализ сдвига геля не подходит для обширных кинетических исследований аполипопротеина N-ацилтрансферазы или для HTS для идентификации ингибирующих молекул. Click-химия с использованием алкиновых жирных кислот была успешно использована для изучения модификации липопротеинов у бактерий5 и метаболизма жирных кислот у эукариот6. Недавно сообщалось, что анализ пальмитоилирования Ras пальмитоилирования in vitro выявил ингибиторы7.
В способе, описанном здесь, очищенный активный Lnt в моющем средстве инкубируют с субстратами в смешанных мицеллах с образованием алкин-триацилированного пептида, который впоследствии обнаруживается флуоресцентной спектрометрией.
Протокол для анализа Lnt, описанный здесь, основанный на флуоресцентном обнаружении триацилированного продукта, является чувствительным и воспроизводимым. Специфическое и эффективное связывание биотина со стрептавидином является ключевым элементом анализа. Субстрат Alkyne-POPE, оставший?…
The authors have nothing to disclose.
Мы благодарим Фабриса Агу и Аликс Бушарла из Платформы химиогеномного и биологического скрининга, Центра технологических ресурсов и исследований (C2RT) в Институте Пастера в Париже за полезные предложения по протоколу, всех членов подразделения BGPB за поддержку и научные обсуждения и Саймона Легуда за критическое прочтение рукописи. Работа финансировалась Глобальными инициативами по уходу Института инфекционных заболеваний Карно и Института микробов и здоровья Карно (15 CARN 0017-01 и 16 CARN 0023-01).
Äkta Purifier FPLC system | GE Healthcare | NA | Purity: NA Lnt purification |
alkyne-POPE | Avanti Polar Lipids | 900414P | Purity: >99% Lnt substrate |
Azido-FAM | Lumiprobe | A4130 | Purity: 100% (pure) Click reagent |
BioPhotometer Plus | Eppendorf | N/A | Purity: NA OD 600 nm |
BioTek ELX 405 Select plate washer | BioTek | N° serie 115800, n° materiel 405 Select | Purity: NA Wash steps |
biotin-fluorescein | Sigma | 53608 | Purity: ≥90% Fluorescence control |
Copper(II) sulfate pentahydrate | Sigma | C3036 | Purity: ≥98% Click reagent |
DDM | Anatrace | D310A | Purity: ≥ 99% β+α; < 15% α Detergent for Lnt purification |
Dimethylsulfoxide (DMSO) | Invitrogen | D12435 | Purity: anhydrous Solbilization Click reagent |
Electronic pipet Voyager 8 channels 0.5-12.5 uL | INTEGRA | 4721 | Purity: NA Handling reagents |
French Pressure Cell | N/A | N/A | Purity: NA Cell disruption |
FSL-1-biotin | EMC microcollections | L7030 | Purity: NA Lnt substrate |
Greiner Bio-One 384-well standard CELLSTAR polystyrene microplate | Greiner | 781091 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
Greiner Bio-One 96-well sterile polystyrene plate, high binding | Greiner | 655097 | Purity: NA Black with transparent bottom (up or bottom reading) |
Microplate reader Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
MTSES (sodium (2-sulfonatoethyl)methanethiosulfonate) | Anatrace | S110MT | Purity: ~100% Thiol specific inhibitor |
Optically Clear Adhesive Seal Sheets | Thermo Scientific | AB-1170 | Purity: NA Foil to seal multi-well plate |
Sephacryl S400 HR 16/60 gel filtration column | GE Healthcare | GE28-9356-04 | Purity: NA Lnt purification |
StrepTactin Sepharose 50 % | IBA Biotechnology | 2-1201-010 | Purity: NA Lnt purification |
streptavidin | Sigma | S4762-1MG | Purity: ≥13 units/mg protein Biotin binding |
TBTA (tris[(1-benzyl-1H-1,2,3-triazol-4-yl)methyl]amine | Sigma | 678937 | Purity: 97% Click reagent |
TCEP (tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride | Sigma | 75259 | Purity: ≥98% Click reagent |
TECAN Infinite F500 | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
TECAN Infinite M1000 pro | Tecan | N/A | Purity: NA Fluorescence detection |
Thermomixer C | Eppendorf | 5382000015 | Purity: NA Heated lid |
Triton X-100 | Sigma | 93443 | Purity: 10% in H2O Lnt reaction buffer |
Ultra centrifuge | Beckman LC | N/A | Purity: NA Cell fractionation |