本文描述了一个高通量协议,用于快速、可靠地确定单个或批量 C.elegans 样本中的基因表达水平。此协议不需要 RNA 隔离,并且直接从样品中生成 cDNA。它可以与高通量多路复用纳米流体实时 qPCR 平台一起使用。
本文对快速、健壮、高度灵敏的 卡诺哈布迪炎患者 进行了高通量反向转录定量PCR(RT-qPCR)检测。此协议从单个蠕虫或批量样本中获取基因表达的精确测量。此处提交的协议提供了对现有补充DNA (cDNA) 制备方法的全新改编,并结合了纳米流体 RT-qPCR 平台。此协议的第一部分名为”蠕虫到CT”,允许 cDNA 直接从线虫生产,而无需事先隔离 mRNA。它通过允许在 3.5 小时内从 96 种蠕虫中制备 cDNA 来增加实验吞吐量。协议的第二部分使用现有的纳米流体技术在 cDNA 上运行高通量 RT-qPCR。本文评估了两种不同的纳米流体芯片:第一种是运行96个样本和96个靶点,在大约1.5天的工作时间里产生9,216个反应。第二个芯片类型由六个 12 x 12 阵列组成,产生 864 个反应。在这里,蠕虫到CT的方法通过量化mRNA水平的基因编码热冲击蛋白从单一蠕虫和散装样品。提供的是一个广泛的引物列表,旨在放大 C.elegans 基因组中大多数编码基因的处理RNA。
单细胞RNA测序和qPCR的优化表明,转录脉冲或爆发可导致每个细胞1的RNA分子数量发生巨大变化。此外,这些技术还发现了标准批量转录测量之前遗漏的大量细胞异质性。根据上下文,一些单细胞转录变异是由组织混合细胞组成引起的。然而,即使在同源细胞群生长在同一环境下,也有广泛的转录异质性2,3。这种”生物变异性”越来越被确定为细胞网络无处不在的特性,从细菌到人类。在某些情况下,它可能对发育、癌症进展、HIV延迟和化疗反应4、5产生表型后果。
线虫卡诺哈布迪炎是研究个体间生物变异的原因和后果的理想特征的独特模型生物体。这些线虫是一个由959个细胞组成的简单模型生物体,其透明的层基使其适合进行体内成像研究。雄性是一种主要通过自肥繁殖的草药物种:这导致了原生实验室菌株。尽管同源性和受控的培养条件,许多表型和成绩单是变化的个体,表明随机或微环境差异有助于异质性在个人7,8。基因表达的这种变异性具有多种健身后果,包括突变的渗透、生存、发育时机和生育能力7、8、9的变异性。由于这些特点,单虫研究为研究整个生物体的生物变异性提供了前所未有的机会。
该领域根本需要开发和优化技术,以准确检测单蠕虫级别的脚本。新技术,如单虫RNA测序10,RNA测序从分离组织11,单细胞测序12现在可用于C.elegans。然而,一个主要的挑战依然存在:在监测个人间时,表达微弱的基因往往低于可检测的13级。这对于从少量起始材料中分离出的稀有成绩单特别相关,因为平均表达和技术差异之间存在着既定的反向关系,往往导致罕见的成绩单低于统计截止点13。高通量多路复用qPCR技术的优化已被证明是有用的哺乳动物单细胞研究,特别是在研究罕见的成绩单14,15的表达。该技术还可用于其他单虫技术的基准和验证目的。
蠕虫到CT是一种快速、稳健的方法,它适应了细胞生物学研究中使用的工具包,用于单蠕虫cDNA制备。通过这种方法获得的cDNA加上多路复用纳米流体qPCR技术被选中,因为它提供了更高的实验吞吐量,更广阔的动态检测范围,并已验证为单细胞目的14,15。所述的 cDNA 制备也适用于标准 PCR 技术。产量在两个方面增加:首先,cDNA制剂比传统的硫酸钛酸-苯酚-氯仿提取更快、更可靠,因为蠕虫直接添加到裂解缓冲器中,跳过了容易降解RNA的直接分离。其次,利用纳米流体技术可显著增加可同时运行的样品和目标的数量。本文比较了两个芯片:单阵列芯片和多阵列芯片。单阵列芯片可以运行 96 个单蠕虫和 96 个引物集,每个实验产生 9,216 个反应。要使用标准 qPCR 技术实现类似的吞吐量,需要使用 96 个井板进行 96 个单独的 qPCR 实验。更小、更灵活的多阵列芯片由六个 12 x 12 阵列组成,可产生 864 个反应。该方法的卓越可靠性和灵敏度通过纳米流体技术和预放大步骤的引入而得到提高。本文中介绍的方法将与最先进的统计算法一起用于提取生物差异。本文介绍了单虫和批次蠕虫样品的快速cDNA制备和高通量qPCR协议:该算法将在其他地方发布。对于此协议,应在实验前准备每个芯片的组织。表 1和表 2分别显示了多阵列和单阵列芯片的这些计划示例。图1中还详细介绍了蠕虫到 CT 协议的概况,并在图2中运行多阵列和单阵列芯片。
本文证明,蠕虫到CT协议是一种快速而高效的方法,可以从单个蠕虫或少量蠕虫中提取RNA。纳米流体系统提供的高通量使其成为单个变异度测量定量的理想之选。此外,这种方法的高灵敏度允许检测在低水平表达的基因,低于检测时,使用单蠕虫RNA-seq技术9。
当考虑从单个蠕虫中选择制备cDNA的方法时。Ly等人29 优化了一种依赖蛋白酶K进行层压消化的协议。层基是分子与蠕虫分离的主要障碍,蛋白酶K提供了一种有效的方法来打破它。然而,蛋白酶K必须热灭活,才能使用酶进行反向转录。虽然 Ly 等人使用 10 分钟暴露在 96 °C 下,但此协议中避免了这一步骤,因为 RNA 很容易降解。而不是使用蛋白酶K,重复的冷冻解冻周期被用来打破层。冻土是打破层层的有效方法,因为每个蠕虫可以分离出更多的RNA。Ly等人报告说,每只蠕虫提取的总RNA是35 ng使用蛋白酶K,而此协议获得51.75克±6.74 SEM的总RNA每蠕虫。与标准协议相比,避免热暴露加上预放大步骤显然扩大了蠕虫到CT的动态检测范围。Ly等人报告绝对 Ct 值为 21.1 ± 0.15 hsp – 16.2 和 22.8 ± 0.17 hsp – 70 在热冲击后。使用相同的热冲击条件(1 小时在 30 °C),此协议获得绝对 Ct 值 17.93 ± 0.57 hsp-16.2 和 21.13 ±0.33 hsp-70.这表明冷冻溶解方法提供更高的RNA产量,更适合低表达成绩单。
纳米流体系统是理想的,当调查一组给定的目标成绩单和使用更小(多阵列芯片)或更大的(单阵列芯片)数量的样本允许适应实验的规模。要获得在单个蠕虫中表达的所有成绩单的不偏不倚的图片,显而易见的选择是使用RNA测序。然而,如果实验的重点是一组较小但仍然相对较大的目标基因,则只要研究人员能够接触到纳米流体PCR机器,利用此方案就更具成本效益。纳米流体系统试剂和单阵列芯片的成本估计约为每只蠕虫13欧元,而单蠕虫测序试剂的成本约为每只蠕虫60欧元,不包括测序成本。
在考虑使用何种 PCR 平台时,与纳米流体 qPCR 相结合的蠕虫到 CT 方法在时间和吞吐量方面具有优势。在大约 2 天的工作时间内,可以获得 9,216 个 RT-qPCR 结果,而使用标准 qPCR 平台放大相同数量的目标大约需要 5 个工作周,使用 96 个井板检测,每天运行 4 个板。但是,如果要测试的目标数量较少,则使用蠕虫到 CT 以及标准 qPCR 机器更具成本效益。单阵列芯片无法重新运行,因此运行空井会降低成本效益。
该方法的一个局限性是在多路复用步骤中潜在地形成入门-入门调色器,但这发生在不到 1% 的情况下。虽然蠕虫到CT协议是有效的,并提供可靠的结果,当应用于单一蠕虫,有一个约5%的失败率,这可能相当于在收获步骤期间蠕虫仍然被困在盖或管顶部的情况。
与更标准的技术相比,这种多功能且可靠的方法共同提高了吞吐量和灵敏度。这种方法对于验证高通量屏幕非常有用,是监测或验证单虫基因表达水平的绝佳选择。这种方法可以应用于其他具有挑战性的技术,如从孤立的组织中量化基因表达。例如,全组织(如肠道、性腺或由 FAC 分离的细胞)的分离提供了足够的材料来进行RNA 测序实验。然而,数量有限的材料往往导致重复阅读,从而排除了对罕见成绩单的量化。在这种情况下,如果研究人员只需要监测这些组织或细胞中所有成绩单的子集,则使用基于纳米流体的技术应增加对实验的敏感性,并提高成本效益。
The authors have nothing to disclose.
我们感谢莎琳·默多克和巴布拉罕研究所设施的支持。JLP 得到威康信托 (093970/Z/10/Z) 的支持,OC 得到 ERC 638426 和 BBSRC [BBS/E/B/B000C0426] 的支持。
100µM stock primers for genes of interest. | |||
20X DNA Binding Dye | Fluidigm | 100-7609 | for 96.96 chip (Single-Array Chip) |
2X Assay Loading Reagent | Fluidigm | 100-7611 | |
384 well plates | |||
8-strip PCR tubes | |||
96 well ice block | |||
96 well plates | |||
96.96 Dynamic Array IFC | Fluidigm | BMK-M-96.96 | Referenced throughout the manuscript as "Single-Array Chip" |
96-well sealing tape | |||
BioMark & EP1 Software | Fluidigm | 101-6793 | Contains: Biomark HD Data Collection software, Real-Time PCR Analysis software, SNP Genotyping Analysis software, Digital PCR Analysis software, Melt Curve Analysis software |
BioMark or BioMark HD system | Fluidigm | 100-2451 K1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics thermocycler" |
Control Line Fluid Kit for 96.96 and FlexSix IFCs | Fluidigm | 89000021 | Referenced throughout manuscript as "control line fluid" |
DNA Suspension buffer | TEKnova | T0021 | |
domed PCR caps | |||
Exonuclease I | New England BioLabs | M0293L | |
Exonuclease I reaction buffer | New England BioLabs | B0293S | |
FLEXsix DELTAgene Sample Reagent | Fluidigm | 100-7673 | referenced throughout manuscript as "sample reagent" |
FLEXsix Gene Expression IFC | Fluidigm | 100-6308 | referenced throughout manuscript as "Multi-Array Chip" |
Fluidigm Real-Time PCR Analysis User Guide | Fluidigm | 68000088 | This is the protocol used as a basis for section 2 of the protocol, referenced within the manuscript. |
IFC Controller MX | Fluidigm | 68000112 I1 | Referenced throughout the manuscript as "nanofluidics PCR priming machine" |
IFC Controllers SOFTWEAR | Fluidigm | 100-2297 | Contains all softwear and scripts required for running the IFC controller MX |
liquid nitrogen in dewar | |||
Microcentrifuge | StarLab | C1301B-230V | Used to spin down PCR tube strips in the protocol. |
Nuclease Free Water | |||
plate spinner | Labnet | K4050725 | mini plate spinner, mps 1000. referenced through the protocol as "tabletop plate spinner" |
Power SYBR Green Cells-to-Ct kit | invitrogen | 4402955 | This kit is that which is adapted for use in nematodes in the Worm-to-CT protocol. Contense: Store Stop Solution, DNase I and 20X RT Enzyme Mix at -20°C. Store Lysis Solution, 2X SYBR RT Buffer (referenced throughout the manuscript as RT buffer), and Power SYBR®Green PCR Master Mix (refferenced througout the manuscript as PCR Master Mix). This Kit is for 400 reactions, kits also available for 40 and 100 reactions. |
PreAmp Master Mix | Fluidigm | 100-5580, 100-5581 | |
Reverse Transcription Master Mix—480 reactions | Fluidigm | 100-6299 | One tube also available for 96 reactions (PN100-6298) |
Rnase Free water | |||
SsoFast EvaGreen Supermix with Low ROX | Bio-Rad Laboratories | 172-5211 | referenced throughout the manuscript as "fluorescent probe supermix" |
Standard 96 and 384-well Thermal Cycler | |||
TE Buffer (10mM Tris, pH8.0, 1.0mM EDTA | TEKnova | T0224 | Referenced throughout the manuscript as Tris-EDTA buffer |
ThermoMixer C | Eppendorf | 5382000031 | Referenced throughout the text as "thermal mixer" |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596026 | Referenced through the protocol as "guanidium thiocyanate-phenol-chloroform" |
Warm water bath |