Test de chimiotaxis in situ pour examiner le comportement microbien dans les écosystèmes aquatiques
Summary
Présenté ici est le protocole pour un test de chimiotaxis in situ, un dispositif microfluidique récemment développé qui permet des études du comportement microbien directement dans l’environnement.
Abstract
Les comportements microbiens, tels que la motilité et la chimiotaxis (la capacité d’une cellule à modifier son mouvement en réponse à un gradient chimique), sont répandus dans les domaines bactérien et archéal. Les chimiotaxis peuvent se traduire par d’importants avantages d’acquisition de ressources dans des environnements hétérogènes. Il joue également un rôle crucial dans les interactions symbiotiques, les maladies et les processus mondiaux, tels que le cyclisme biogéochimique. Cependant, les techniques actuelles limitent la recherche de chimiotaxis au laboratoire et ne sont pas facilement applicables sur le terrain. Présenté ici est un protocole étape par étape pour le déploiement de l’essai in situ chemotaxis (ISCA), un dispositif qui permet un interrogatoire robuste de chimiotaxis microbienne directement dans l’environnement naturel. L’ISCA est un dispositif microfluidique composé d’un réseau de 20 puits, dans lequel les produits chimiques d’intérêt peuvent être chargés. Une fois déployés dans des environnements aqueux, les produits chimiques se diffusent hors des puits, créant des gradients de concentration auxquels les microbes sentent et réagissent en nageant dans les puits par le biais de chimiotaxis. Le contenu du puits peut ensuite être échantillonné et utilisé pour (1) quantifier la force des réponses chimiotaxiques à des composés spécifiques par cytométrie de flux, (2) isoler et la culture des micro-organismes sensibles, et (3) caractériser l’identité et le potentiel génomique des populations répondantes par des techniques moléculaires. L’ISCA est une plate-forme flexible qui peut être déployée dans n’importe quel système avec une phase aqueuse, y compris les milieux marins, d’eau douce et de sol.
Introduction
Divers micro-organismes utilisent la motilité et la chimiotaxis pour exploiter des environnements nutritifs irréguliers, trouver des hôtes, ou éviter les conditions délétères1,2,3. Ces comportements microbiens peuvent à leur tour influencer les taux de transformation chimique4 et favoriser des partenariats symbiotiques entre les écosystèmes terrestres, d’eau douce et marins2,5.
Chemotaxis a été largement étudié dans des conditions de laboratoire pour les 60 dernières années6. La première méthode quantitative pour étudier la chimiotaxis, l’essai capillaire, implique un tube capillaire rempli d’un chimioattractant putatif immergé dans une suspension de bactéries6. La diffusion du produit chimique hors du tube crée un gradient chimique, et les bactéries chimiotaxiques réagissent à ce gradient en migrant dans le tube7. Depuis le développement de l’essai capillaire, encore largement utilisé aujourd’hui, de nombreuses autres techniques ont été développées pour étudier la chimiotaxis dans des conditions physiques/chimiques de plus en plus contrôlées, la plus récente impliquant l’utilisation de microfluidiques8,9,10.
La microfluidique, associée à la microscopie vidéo à haute vitesse, permet de suivre le comportement des cellules individuelles en réponse à des gradients soigneusement contrôlés. Bien que ces techniques aient grandement amélioré notre compréhension de la chimiotaxis, elles ont été limitées à l’utilisation en laboratoire et ne se traduisent pas facilement par le déploiement sur le terrain dans les systèmes environnementaux. Par conséquent, la capacité des communautés naturelles de bactéries à utiliser des chimiotaxis dans les écosystèmes naturels n’a pas été examinée; ainsi, la compréhension actuelle de l’importance écologique potentielle de la chimiotaxis est biaisée vers des conditions artificielles de laboratoire et un nombre limité d’isolats bactériens de culture en laboratoire. L’ISCA récemment développé surmonte ces limitations11.
L’ISCA s’appuie sur le principe général de l’essai capillaire; cependant, il utilise des techniques modernes de microfabrication pour fournir une plate-forme expérimentale hautement répliquée et facilement déployable pour la quantification de la chimiotaxis vers des composés d’intérêt pour l’environnement naturel. Il permet également l’identification et la caractérisation des micro-organismes chimiotaxiques par l’isolement direct ou les techniques moléculaires. Alors que le premier dispositif de travail a été auto-fabriqué et construit en verre et PDMS11, la dernière version moulée par injection est composée de polycarbonate, en utilisant une procédure de fabrication très standardisée (pour l’intérêt pour la dernière version de l’appareil, les auteurs correspondants peuvent être contactés).
L’ISCA est de la taille d’une carte de crédit et se compose de 20 puits répartis dans un réseau de puits de 5 x 4, chacun relié à l’environnement aquatique externe par un petit port (800 μm de diamètre; Figure 1). Les chimioattractants putatifs chargés dans les puits se diffusent dans l’environnement via le port, et les microbes chimiotaxiques réagissent en nageant à travers le port dans le puits. Comme de nombreux facteurs peuvent influer sur le résultat d’une expérience isca dans l’environnement naturel, ce protocole étape par étape aidera les nouveaux utilisateurs à surmonter les obstacles potentiels et à faciliter des déploiements efficaces.
Protocol
Representative Results
Discussion
À l’échelle des micro-organismes aquatiques, l’environnement est loin d’être homogène et se caractérise souvent par des gradients physiques/chimiques qui structurent les communautés microbiennes1,15. La capacité des micro-organismes motiles à utiliser le comportement (c.-à-d. la chimiotaxis) facilite la recherche de nourriture dans ces microenvironnements hétérogènes1. L’étude de la chimiotaxis directement dans l’env…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche a été financée en partie par la Gordon and Betty Moore Foundation Marine Microbiology Initiative, par le biais de la subvention GBMF3801 à J.R.S. et R.S., et un prix d’enquêteur (GBMF3783) à R.S., ainsi qu’une bourse du Conseil australien de recherche (DE160100636) à J.B.R., un prix de la Fondation Simons à B.S.L. (594111), et une subvention de la Fondation Simons (542395) à R.S. dans le cadre des Principes microbiens des écosystèmes microbiens (PriME) Collaborative.
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
Referências
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