ב סיטו Chemotaxis אסאי לבחון התנהגות מיקרוביאלית במערכות אקולוגיות מימיות
Summary
מוצג כאן הוא הפרוטוקול עבור סיסאי chemotaxis סיטו, מכשיר מיקרופלויד שפותח לאחרונה המאפשר מחקרים של התנהגות מיקרוביאלית ישירות בסביבה.
Abstract
התנהגויות מיקרוביאליות, כגון תנועתיות וchemotaxis (היכולת של תא לשנות את תנועתו בתגובה הדרגתי כימי), נפוצים על פני התחומים חיידקיים וארכאיים. Chemotaxis יכול לגרום יתרונות משמעותיים רכישת משאבים בסביבות הטרוגניות. הוא גם ממלא תפקיד מכריע באינטראקציות סימביוטיות, מחלות, ותהליכים גלובליים, כגון רכיבה ביו-גיאוכימית. עם זאת, הטכניקות הנוכחיות להגביל את המחקר chemotaxis למעבדה והם לא ישימים בקלות בתחום. מוצג כאן הוא פרוטוקול שלב אחר שלב לפריסה של סיסטו chemotaxis assay (ISCA), מכשיר המאפשר חקירה חזקה של chemotaxis מיקרוביאלי ישירות בסביבה הטבעית. ISCA הוא מכשיר מיקרו-נוזלים המורכב ממערך של 20 בארות, שבו ניתן לטעון כימיקלים בעלי עניין. לאחר הפריסה בסביבות מימיות, כימיקלים לפזר מתוך הבארים, יצירת מעברי ריכוז כי חיידקים תחושה ולהגיב על ידי שחייה לתוך הבארים באמצעות chemotaxis. לאחר מכן ניתן לדגום את תכולת הבאר ולהשתמש בה כדי לכמת (1) את עוצמת התגובות הכימותרפיות לתרכובות ספציפיות באמצעות ציטומטריית זרימה, (2) לבודד ולתרבות מיקרואורגניזמים מגיבים, ו-(3) לאפיין את הזהות והפוטנציאל הגנומי של האוכלוסיות המגיבות באמצעות טכניקות מולקולריות. ISCA היא פלטפורמה גמישה שניתן לפרוס בכל מערכת עם שלב מים, כולל סביבות ימיות, מים מתוקים וקרקע.
Introduction
מיקרואורגניזמים מגוונים להשתמש בתנועתיות ו chemotaxis כדי לנצל סביבות תזונתיות לא אחידות, למצוא מארחים, או להימנעתנאים מזיקים 1,,2,,3. התנהגויות מיקרוביאליות אלה יכולות בתורן להשפיע על שיעוריהטרנספורמציה הכימית 4 ולקדם שותפויות סימביוטיות על פני מערכות אקולוגיות ארציות, מים מתוקיםומערכות אקולוגיות ימיות 2,5.
Chemotaxis נחקר בהרחבה בתנאי מעבדה במשך 60 השנים האחרונות6. השיטה הכמותית הראשונה ללמוד chemotaxis, תסיסה נימי, כרוך צינור נימי מלא כימותרפיה putative שקוע השעיה שלחיידקים 6. דיפוזיה של הכימיקל מתוך הצינור יוצר מעבר צבע כימי, וחיידקים chemotactic להגיב הדרגתי זה על ידי נדידה לתוך צינור7. מאז הפיתוח של תסיסה נימי, עדיין בשימוש נרחב כיום, טכניקות רבות אחרות פותחו כדי ללמוד chemotaxis בתנאים פיזיים / כימיים מבוקרים יותר ויותר, עם האחרונה מעורבים בשימוש microfluidics8,,9,,10.
מיקרו-נוזלים, יחד עם מיקרוסקופית וידאו במהירות גבוהה, מאפשרים מעקב אחר התנהגותם של תאים בודדים בתגובה לשינועים מבוקרים בקפידה. למרות טכניקות אלה שיפרו במידה רבה את ההבנה שלנו של chemotaxis, הם הוגבלו לשימוש במעבדה ולא לתרגם בקלות פריסת שדה במערכות סביבתיות. כתוצאה מכך, היכולת של קהילות טבעיות של חיידקים להשתמש chemotaxis בתוך מערכות אקולוגיות טבעיות לא נבדקה; לפיכך, ההבנה הנוכחית של החשיבות האקולוגית הפוטנציאלית של chemotaxis מוטה כלפי תנאי מעבדה מלאכותיים ומספר מוגבל של מבודדים חיידקיים במעבדה.תרבית. ISCA שפותח לאחרונה מתגבר על מגבלות אלה11.
ISCA בונה על העיקרון הכללי של ההתכחה ניח; עם זאת, הוא עושה שימוש בטכניקות microfabrication מודרניות כדי לספק פלטפורמה ניסיונית משוכפלת מאוד, לפריסה בקלות לכימות של chemotaxis כלפי תרכובות של עניין בסביבה הטבעית. הוא גם מאפשר זיהוי ואפיון של מיקרואורגניזמים כימיים על ידי בידוד ישיר או טכניקות מולקולריות. בעוד מכשיר העבודה הראשון היה מפוברק עצמו ונבנה זכוכית PDMS11, הגרסה האחרונה הזרקה מעוצב מורכב פוליקרבונט, באמצעות הליך ייצור מתוקן מאוד (לעניין בגרסה העדכנית ביותר של המכשיר, המחברים המתאימים ניתן ליצור קשר).
ISCA הוא בגודל כרטיס אשראי ומורכב 20 בארות מופץ במערך 5 x 4 בארות, כל המקושר לסביבה הימית החיצונית על ידי נמל קטן (800 μm קוטר; איור 1). כימותרפיה פוטטיבית נטען לתוך בארות מפוזרים לתוך הסביבה דרך הנמל, וחיידקים chemotactic להגיב על ידי שחייה דרך הנמל לתוך הבאר. כמו גורמים רבים יכולים להשפיע על התוצאה של ניסוי ISCA בסביבה הטבעית, פרוטוקול שלב אחר שלב זה יסייע למשתמשים חדשים להתגבר על מכשולים פוטנציאליים ולהקל על פריסות יעילות.
Protocol
Representative Results
Discussion
בקנה מידה של מיקרואורגניזמים ימיים, הסביבה רחוקה מלהיות הומוגנית ומאופיינת לעתים קרובות על ידי מעברי צבע פיזיים/כימיים המוסיינים קהילות מיקרוביאליות1,15. היכולת של מיקרואורגניזמים מוטיב להשתמש בהתנהגות (כלומר, chemotaxis) מקל על חיפוש מזון בתוך מיקרו מיקרו-סביב…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה מומן בחלקו על ידי יוזמת המיקרוביולוגיה הימית של קרן גורדון ובטי מור, באמצעות מענק GBMF3801 לג’יי.אר.ס ו-ר.ס, ופרס חוקר (GBMF3783) ל-R.S., כמו גם מלגת מועצת המחקר האוסטרלית (DE160100636) לג’יי.בי.אר, פרס מקרן סימונס ל-B.S.L. (594111) ומענק מקרן סימונס (542395) ל-R.S. כחלק מעקרונות המערכות האקולוגיות המיקרוביאליות (PriME).
Materials
| Acrylic glue | Evonik | 1133 | Acrifix 1S 0116 |
| Acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K725 | Or different company |
| Adhesive tape | Scotch | 3M 810 | Scotch Magic tape |
| Autoclave | Systec | D-200 | Or different company |
| Benchtop centrifuge | Fisher Scientific | 75002451 | Or different company |
| Bungee cord | Paracord Planet | 667569184000 | Or different company |
| Centrifuge tube – 2 mL | Sigma Aldrich | BR780546-500EA | Eppendorf tube |
| Conical centrifuge tube – 15 mL | Fisher Scientific | 11507411 | Falcon tube |
| Conical centrifuge tube – 50 mL | Fisher Scientific | 10788561 | Falcon tube |
| Deployment arm | Irwin | 1964719 | Or different company |
| Deployment enclosure plug | Fisher Scientific | 21-236-4 | See alternatives in manuscript |
| Disposable wipers | Kimtech – Fisher Scientific | 06-666 | Kimwipes |
| Flow cytometer | Beckman | C09756 | CYTOFlex |
| Glutaraldehyde 25% | Sigma Aldrich | G5882 | Or different company |
| Green fluorescent dye | Sigma Aldrich | S9430 | SYBR Green I – 1:10,000 final dilution |
| Hydrophilic GP filter cartridge – 0.2 µm | Merck | C3235 | Sterivex filter |
| In Situ Chemotaxis Assay (ISCA) | – | – | Contact corresponding authors |
| Laser cutter | Epilog Laser | Fusion pro 32 | Or different company |
| Luria Bertani Broth | Sigma Aldrich | L3022 | Or different company |
| Marine Broth 2216 | VWR | 90004-006 | Difco |
| Nylon slotted flat head screws | McMaster-Carr | 92929A243 | M 2 × 4 × 8 mm |
| Pipette set | Fisher Scientific | 05-403-151 | Or different company |
| Pipette tips – 1 mL | Fisher Scientific | 21-236-2A | Or different company |
| Pipette tips – 20 µL | Fisher Scientific | 21-236-4 | Or different company |
| Pipette tips – 200 µL | Fisher Scientific | 21-236-1 | Or different company |
| Sea salt | Sigma Aldrich | S9883 | For artificial seawater |
| Serological pipette – 50 mL | Sigma Aldrich | SIAL1490-100EA | Or different company |
| Syringe filter – 0.02 µm | Whatman | WHA68091002 | Anatop filter |
| Syringe filter – 0.2 µm | Fisher Scientific | 10695211 | Or different company |
| Syringe needle 27G | Henke Sass Wolf | 4710004020 | 0.4 × 12 mm |
| Syringes – 1 mL | Codau | 329650 | Insulin Luer U-100 |
| Syringes – 10 mL | BD | 303134 | Or different company |
| Syringes – 50 mL | BD | 15899152 | Or different company |
| Tube rack – 15 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Tube rack – 50 mL | Thomas Scientific | 1159V80 | Or different company |
| Uncoated High-Speed Steel General Purpose Tap | McMaster-Carr | 8305A77 | Or different company |
| Vacuum filter – 0.2 µm | Merck | SCGPS05RE | Steritop filter |
Referências
- Stocker, R. Marine microbes see a sea of gradients. Science. 338, 628-633 (2012).
- Raina, J. B., Fernandez, V., Lambert, B., Stocker, R., Seymour, J. R. The role of microbial motility and chemotaxis in symbiosis. Nature Reviews Microbiology. 17, 284-294 (2019).
- Chet, I., Asketh, P., Mitchell, R. Repulsion of bacteria from marine surfaces. Applied Microbiology. 30, 1043-1045 (1975).
- Smriga, S., Fernandez, V. I., Mitchell, J. G., Stocker, R. Chemotaxis toward phytoplankton drives organic matter partitioning among marine bacteria. PNAS. 113, 1576-1581 (2016).
- Matilla, M., Krell, T. The effect of bacterial chemotaxis on host infection and pathogenicity. FEMS Microbiology Reviews. 42, (2018).
- Adler, J. Chemotaxis in bacteria. Science. 153, 708-716 (1966).
- Adler, J., Dahl, M. M. A method for measuring the motility of bacteria and for comparing random and non-random motility. Journal of General Microbiology. 46, 161-173 (1967).
- Ahmed, T., Shimizu, T. S., Stocker, R. Microfluidics for bacterial chemotaxis. Integrative Biology. 2, 604-629 (2010).
- Hol, F. J. H., Dekker, C. Zooming in to see the bigger picture: microfluidic and nanofabrication tools to study bacteria. Science. 346, 1251821 (2014).
- Rusconi, R., Garren, M., Stocker, R. Microfluidics expanding the frontiers of microbial ecology. Annual Review of Biophysics. 43, 65-91 (2014).
- Lambert, B. S., et al. A microfluidics-based in situ chemotaxis assay to study the behaviour of aquatic microbial communities. Nature Microbiology. 2, 1344-1349 (2017).
- Marie, D., Partensky, F., Jacquet, S., Vaulot, D. Enumeration and cell cycle analysis of natural populations of marine picoplankton by flow cytometry using the nucleic acid stain SYBR Green I. Applied Environmental Microbiology. 63, 186-193 (1997).
- Rinke, C., et al. Obtaining genomes from uncultivated environmental microorganisms using FACS-based single-cell genomics. Nature Protocols. 9, 1038-1048 (2014).
- Gaworzewska, E. T., Carlile, M. J. Positive chemotaxis of Rhizobium leguminosarum and other bacteria towards root exudates from legumes and other plants. Microbiology. , (1982).
- Walker, T. S., Bais, H. P., Grotewold, E., Vivanco, J. M. Root exudation and rhizosphere biology. Plant Physiology. 132, 44-51 (2003).
