In Situ Detection of Ribonucleoprotein Complex Assembly in the C. elegans Germline usando Ensaio de Ligação de Proximidade

Estima-se que mais de 80% das proteínas tenham interações com outras moléculas¹, o que enfatiza a importância dos IPP para a execução de funções biológicas específicas na célula². Algumas proteínas funcionam como hubs facilitando a montagem de complexos maiores que são necessários para a sobrevivência celular¹. Esses hubs mediam vários PPIs e ajudam a organizar proteínas em uma rede que facilita funções específicas em uma célula³. A formação de complexos proteicos também é afetada pelo contexto biológico, como a presença ou ausência de parceiros de interação específicos⁴, eventos de sinalização celular e estágio de desenvolvimento de uma célula.

C. elegans é comumente usado como um organismo modelo para uma variedade de estudos, incluindo o desenvolvimento. A simples anatomia deste animal é composta por vários órgãos, incluindo a gonade, intestino e cutícula transparente, o que facilita a análise do desenvolvimento de vermes. A germinação residente na gônada é uma ótima ferramenta para estudar como as células-tronco germinais amadurecem em gametas⁵ que se desenvolvem em embriões e, eventualmente, na próxima geração de descendentes. A região distal da ponta da germinação contém um pool de células-tronco auto-renovadoras (Figura 1). À medida que as células-tronco saem do nicho, elas avançam para o pacitene meiotico e eventualmente se desenvolvem em oócitos na fase adulta jovem (Figura 1). Este programa de desenvolvimento na germinação é fortemente regulado através de diferentes mecanismos, incluindo uma rede reguladora pós-transcricional facilitada por proteínas de ligação de RNA (RBPs)⁶. Os PPIs são importantes para essa atividade regulatória, pois os RBPs se associam a outros cofatores para exercer suas funções.

Existem várias abordagens que podem ser usadas para sondar ppis no worm, mas cada uma tem limitações únicas. A imunoprecipitação in vivo (IP) pode ser usada para isolar complexos proteína-proteína de extratos inteiros de vermes; no entanto, essa abordagem não indica onde o PPI ocorre no worm. Além disso, complexos proteicos que são transitórios e só se formam durante um estágio específico de desenvolvimento ou em um número limitado de células podem ser difíceis de recuperar por co-imunoprecipitação. Finalmente, os experimentos de IP precisam abordar as preocupações do resortment complexo de proteínas após a lipose e a retenção não específica de proteínas na matriz de afinidade.

Abordagens alternativas para detecção in situ de PPIs são co-imunocoloração, transferência de energia de ressonância Förster (FRET) e complementação de fluorescência bimolecular (BiFC). A co-imunocoloração depende da detecção simultânea de duas proteínas de interesse no tecido de verme fixo e da medição da extensão da colocalização do sinal. O uso da microscopia de superresolução, que oferece maior detalhe do que a microscopia padrão^7,ajuda a testar mais rigorosamente a colocalização de proteínas além da barreira limitada à difração de 200-300 nm⁸. No entanto, a co-imunocoloração usando microscopia convencional e de superresolução funciona melhor para proteínas com padrões de localização bem definidos. Em contraste, torna-se muito menos informativo para parceiros interagindo difundidos. A medição para co-localização de sinais com base na sobreposição não fornece informações precisas sobre se as proteínas estão em complexo entre si^9,10.

Além disso, a co-imunoprecipitação e a co-imunocoloração de complexos proteína-proteína não são quantitativas, tornando desafiador determinar se tais interações são significativas. FRET e BiFC são técnicas baseadas em fluorescentes. Fret baseia-se na marcação de proteínas de interesse com proteínas fluorescentes (FPs) que têm sobreposição espectral na qual a energia de um FP (doador) é transferida para outro FP (aceitador)¹¹. Esta transferência não radiativa de energia resulta em fluorescência do FP aceitador que pode ser detectada em seu respectivo comprimento de onda de emissão. O BiFC baseia-se na reconstituição de uma proteína fluorescente in vivo. Implica a divisão do GFP em dois fragmentos complementares, como helicos 1-10 e hélice 11¹², que são então fundidos a duas proteínas de interesse. Se essas duas proteínas interagirem, os fragmentos complementares do GFP ficam próximos o suficiente na proximidade de dobrar e montar, reconstituindo o fluoróforo GFP. O GFP reconstituído é então observado diretamente como fluorescência e indica onde ocorreu um PPI.

Como tal, tanto fret quanto BiFC dependem de grandes marcas fluorescentes que podem interromper a função da proteína marcada. Além disso, FRET e BiFC requerem expressão abundante e comparável das proteínas marcadas para obter dados precisos. Fret pode não ser adequado para experimentos onde um parceiro esteja acima do outro, o que pode levar a um fundo alto¹³. A superexpressão em experimentos BiFC também deve ser evitada, pois isso pode induzir uma montagem inespecífica¹⁴ que resulta em aumento de fundo. Ambas as técnicas requerem otimização das condições de expressão e imagem das proteínas marcadas, o que pode prolongar o tempo necessário para concluir experimentos.

O ensaio de ligadura de proximidade (PLA) é uma abordagem alternativa que pode abordar as limitações das técnicas mencionadas acima. Pla aproveita anticorpos primários que reconhecem as proteínas de interesse (ou suas etiquetas). Estes anticorpos primários são então ligados por anticorpos secundários contendo sondas oligonucleotídeas que podem hibridizar uns com os outros quando dentro de uma distância de 40 nm (ou menor)¹⁵. O DNA hibridizado resultante é amplificado através de uma reação pcr, que é detectada por sondas que complementam o DNA. Isso resulta em focos que são visualizados por um microscópio. Esta tecnologia pode detectar PPIs in situ em tecidos complexos (ou seja, a gônada do verme), que é organizado como uma linha de montagem contendo células em vários estágios de desenvolvimento e diferenciação. Com o PLA, os PPIs podem ser visualizados diretamente em uma gonada de worm fixo, o que é vantajoso para investigar se os PPIs ocorrem durante um estágio específico de desenvolvimento. O PLA oferece maior resolução dos PPIs em oposição aos ensaios baseados em co-localização, o que é ideal para fazer medições precisas. Se utilizada, a microscopia de superresolução tem o potencial de fornecer detalhes mais finos sobre a localização de focos de PLA dentro de uma célula. Outra vantagem é que os focos resultantes das reações do PLA podem ser contados por um fluxo de trabalho de análise baseado em ImageJ, tornando essa técnica quantitativa.

A família LC8 de cadeias leves de dynein foi descrita pela primeira vez como uma subunidade do complexo motor dynein¹⁶ e hipótese para servir como um adaptador de carga. Desde sua descoberta inicial, lc8 foi encontrado em múltiplos complexos proteicos, além do complexo motor dynein^17,18,19,20. A varredura de seqüências proteicas que contenham o motivo de interação LC8¹⁹ sugere que lc8 pode ter muitas interações com uma ampla gama de proteínas diferentes^{17,18,,19,,20,21,22}. Como resultado, as proteínas familiares LC8 são agora consideradas polos que ajudam a promover a montagem de grandes complexos proteicos^19,22, como conjuntos de proteínas intrinsecamente desordenadas²¹.

Uma proteína c. elegans LC8-family, dynein light chain-1 (DLC-1), é amplamente expressa em muitos tecidos e não enriquecida em estruturas subcelulares específicas^23,24. Consequentemente, a identificação de parceiros biologicamente relevantes in vivo de DLC-1 em C. elegans é desafiadora por uma série de razões: 1) co-imunoprecipitação não indica a fonte tecidual onde a interação ocorre; 2) a expressão limitada de parceiros específicos ou interações transitórias pode dificultar a capacidade de detectar uma interação por co-imunoprecipitação; e 3) a distribuição difusa do DLC-1 leva à sobreposição não específica com proteínas potenciais parceiras por co-imunocoloração. Com base nesses desafios, o PLA é uma abordagem ideal para testar interações in vivo com o DLC-1.

Foi relatado anteriormente que o DLC-1 interage diretamente e serve como cofator para as proteínas de ligação de RNA (RBPs) FBF-2²³ e GLD-1²⁵. Nosso trabalho suporta o modelo de DLC-1 servindo como uma proteína hub e sugere que o DLC-1 facilita uma rede de interação que vai além da dynein^19,22. Usando um ensaio de retirada GST, um novo RBP de interação DLC-1 chamado OMA-1 foi identificado²⁶. OOMA-1 é importante para o crescimento de oócitos e maturação meiótica²⁷ e funciona em conjunto com uma série de repressores e ativadores translacionais²⁸. Enquanto fbf-2 e GLD-1 são expressos nas células-tronco e regiões de pacitene meiotic, respectivamente, OMA-1 é expressa difusamente na germinação do pacitene meiotico através dos oócitos²⁷ (Figura 1). Isso sugere que o DLC-1 forma complexos com RBPs em diferentes regiões da gônada. Verificou-se também que a interação direta entre DLC-1 e OMA-1 observada in vitro não é recuperada por um IP in vivo. O PLA tem sido usado com sucesso como uma abordagem alternativa para estudar mais essa interação na germinação c. elegans, e os resultados sugerem que o PLA pode ser usado para sondar muitos outros PPIs no worm.

NOTA: Este protocolo usa cepas de C. elegans nas quais potenciais parceiros interagindo são marcados. Recomenda-se fortemente que seja usada uma cepa de controle negativa, na qual não se espera que uma proteína marcada interaja com outro parceiro de interação do candidato marcado. Aqui, somente o GFP foi usado como um controle negativo para avaliar o fundo, já que não se espera que o DLC-1 interaja com o GFP no worm. O MA-1 com marca GFP foi usado como cepa experimental, pois dados preliminares sugerem uma interação com o DLC-1. As cepas de nematoide que co-expressam o controle e testam proteínas com DLC-1 com marca 3xFLAG são referidas neste texto como 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (cepas disponíveis mediante solicitação; mais informações na Tabela de Materiais),respectivamente. Aqui, as tags 3xFLAG e GFP são usadas; no entanto, outras etiquetas podem ser substituídas desde que seus anticorpos sejam compatíveis com os reagentes do kit PLA.

1. Cuidados com animais

1. Mantenha os vermes nas placas médias de crescimento de nematóides (NGM) que são semeadas com a cepa OP50 de E. coli e mantêm a 24 °C para a expressão ideal de GFP.
2. Passe vermes adultos a cada 2-3 dias para propagar vermes e mantê-los bem alimentados.

2. Preparação da cultura síncrona

1. Sincronize vermes branqueando um prato de hermafroditas bem alimentados e gravid. Um protocolo de branqueamento é descrito em Porta-de-la-Riva et al.²⁹. Deixe os embriões chocarem durante a noite em um tubo de centrífuga a 24 °C enquanto a extremidade rotativa termina em 10 mL de tampão de mídia mínima M9 (M9). Isso produzirá uma cultura de larvas L1 presas.
2. Incubar o tubo de larvas de estágio L1 presas no gelo por 10 min, em seguida, cubra o tubo com gelo frio 1x M9.
3. Use uma centrífuga para pellet as larvas a 600 x g por 5 min a 4 °C. Atribua cuidadosamente o sobrenadante para que apenas 1-2 mL de sobrenadante permaneça.
4. Re-suspender a pelota de larvas e usar uma micropipeta para transferir 2 μL de cultura de larvas suspensas para um escorregador de vidro. Conte quantas larvas estão presentes para determinar a densidade da cultura das larvas, o que ajudará a guiar a semeada dos vermes na etapa 2.5.
   NOTA: Uma densidade de 10-15 larvas L1/1 μL funciona bem para a semeada.
5. Use uma micropipeta para transferir o volume de cultura de larvas necessário para semear aproximadamente 100-120 larvas de estágio L1 em uma placa OP50 de 60 mm. Por exemplo, sementes 10 μL de uma cultura de larvas que tem uma densidade de 10 larvas L1 /1 μL de cultura.
   NOTA: Não exceda um volume de 40 μL para semear as larvas, ou o excesso de líquido irá interromper o gramado OP50. Se o volume de cultura exceder 40 μL, repita as etapas 2.3-2.4 para reduzir ainda mais o volume e aumentar a densidade da cultura das larvas.
6. Cresça vermes a 24 °C. Registre o tempo em que os L1 semeados na placa e verifique periodicamente o estágio de desenvolvimento para identificar o momento ideal para dissecção.
   NOTA: Às 52 h após a semeada de L1s, os vermes cultivados a 24 °C estão tipicamente na fase adulta jovem, que é o estágio ideal para dissecação para PLA com alvo de gonad. No entanto, o tempo real em que os vermes sincronizados atingem o estágio adulto jovem pode variar entre cepas e temperatura de incubação.

3. Dissecção/extrusão de gonad

NOTA: A dissecção para extrusão da gonad é necessária para que o PLA direcionado à gonad funcione com sucesso. Essa abordagem também pode liberar embriões, que também funcionam usando este protocolo para PLA (ver Discussão para obter mais informações). Após a dissecção, tanto o controle negativo quanto as amostras experimentais são fixas e tratadas para PLA em paralelo. Sugere-se também que um conjunto adicional de amostras seja preparado para fins de co-imunocoloração fluorescente²³ para demonstrar padrões de expressão dos parceiros proteicos de interesse.

1. Escolha 30-40 vermes adultos jovens em uma caixa de vidro de relógio contendo 500 μL de 1x M9 + levamisole (concentração final de 2,5 mM). Depois de coletar os vermes, remova cuidadosamente e descarte a maioria da mídia para remover bactérias que são transferidas junto com os vermes.
2. Adicione 500 μL frescos de 1x M9 + levamisole e use a pipeta para elaborar suavemente e distribuir a mídia para enxaguar os vermes. Remova cuidadosamente e descarte a maioria da mídia para limpar as bactérias que são transferidas junto com os vermes.
   1. Repita esta etapa 2x-3x até que todas as bactérias sejam removidas. Depois que as lavadas forem concluídas, deixe os vermes em cerca de 100 μL de mídia para se manter hidratado.
      NOTA: Não deixe os vermes sentarem na mídia por mais de 7 min, pois isso prejudicará a extrusão das gonades durante a dissecação. Realizar lava-ouças sob o auxílio de microscópio de dissecação para monitorar a remoção da mídia para que os vermes não sejam perdidos.
3. Utilizando uma pipeta de vidro ou polietileno, transfira os vermes para um slide de microscópio de 25 mm x 75 mm revestido com 0,001% poli-L-lisina (slides usados neste procedimento têm um perímetro revestido de epóxi, deixando três espaços de trabalho, 14 mm x 14 mm cada). Remova o excesso de mídia para que aproximadamente 10-15 μL de mídia permaneça.
4. Sob o auxílio de um microscópio de dissecação e usando duas agulhas de calibre 261/2, coloque uma agulha sobre a outra para que as extremidades formem um par de tesouras. Usando agulhas orientadas desta forma, corte vermes atrás da faringe para liberar as germinações. Disseque todos os vermes em 5 minutos.
   NOTA: Mais detalhes sobre como realizar dissecções podem ser encontrados em uma publicação anterior por Gervaise e Arur³⁰.
5. Depois que todos os vermes forem dissecados, coloque suavemente um deslizamento de cobertura de 22 mm x 40 mm sobre o escorregador de modo que ele seja perpendicular ao slide. As extremidades do deslizamento de cobertura devem ser penduradas fora do escorregador.
6. Congele os slides em um bloco de alumínio pré-refrigerado mantido em gelo seco por pelo menos 20 min. Coloque suavemente um lápis refrigerado em cima do deslizamento de cobertura para evitar que o deslizamento de cobertura se solte devido à expansão do gelo.

4. Fixação/bloqueio

1. Quando estiver pronto para a fixação, retire as tampas com um lápis ou outra ferramenta de borda cega e mergulhe imediatamente o escorregador em um frasco contendo metanol fresco e gelado (refrigerado a -20 °C) por 1 min.
2. Limpe suavemente as bordas do slide que circundam a amostra para que o próximo reagente seja mantido pela tensão superficial ao redor da amostra. Aplique 150 μL de fixação (2% de formaldeído em 100 mM KH₂PO_4, pH = 7,2) por 5 min em RT.
   NOTA: Também testamos um procedimento de fixação de metanol/acetona^31,32 e descobrimos que ele é compatível com a reação do PLA.
3. Toque o slide em uma toalha de papel em um ângulo perpendicular de 90° para deixar o fixador escorrer do slide e absorver na toalha de papel. Bloco desliza 2x por 15 min em RT em um frasco coplin com 50 mL de 1x PBS/1% Triton X-100/1% de albumina de soro bovino (PBT/BSA).
   NOTA: Os frascos de coplin ou outros tipos de frascos de coloração são recomendados para esta etapa de bloqueio e as etapas de lavagem abaixo nas seções 6-9. Estes fornecem volumes suficientes para uma troca eficiente de tampão de bloqueio ou lavagem com a amostra.
4. Bloqueie slides com uma solução PBT/BSA contendo soro de cabra 10% normal. Limpe suavemente as bordas que circundam o slide e aplique 100 μL da solução ao slide. Incubar por 1h em RT em uma câmara úmida.
   NOTA: Esta etapa é altamente recomendada para coloração com o anticorpo primário αFLAG. A câmara úmida é construída prendendo pipetas de vidro com fita adesiva na bandeja para que os slides se deitem enquanto incubam. Os lenços umedecidos(Tabela de Materiais)são colocados na bandeja para elevar a umidade interna da bandeja para evitar a evaporação. A tampa e a bandeja estão cobertas em papel alumínio para proteger as amostras da luz durante as etapas sensíveis à luz.
5. Coloque o slide sobre uma toalha de papel para deixar a solução PBT/BSA/10%NGS sair do slide e limpar suavemente as bordas do slide. Use o reagente de bloqueio(Tabela de Materiais)para bloquear slides. Aplique uma gota no espaço de 14 mm x 14 mm. Incubar slides por 1 h a 37 °C em uma câmara úmida.

5. Incubação primária de anticorpos

NOTA: Para obter os melhores resultados de PLA e o fundo mínimo, o fator de diluição dos anticorpos primários pode exigir otimização (ver Discussão para mais detalhes). Além disso, os anticorpos primários devem ser levantados em diferentes hosts que correspondam à especificidade dos anticorpos secundários usados para PLA.

1. Coloque o slide sobre uma toalha de papel para deixar o reagente de bloqueio sair do escorregador e limpe suavemente as bordas. Use o diluente de anticorpos(Tabela de Materiais)para diluir os anticorpos primários. Aplique 40 μL de solução de anticorpos primários por espaço de 14 mm x 14 mm.
2. Incubar desliza em uma câmara úmida durante a noite a 4 °C.

6. Incubação da sonda PLA (anticorpo secundário)

NOTA: Para as etapas 6-9, use os buffers de lavagem A e B em RT. Se os buffers estiverem armazenados a 4 °C, deixe-os aquecer em RT antes de usá-los.

1. Lave slides 2x para 5 min com 50 mL de tampão de lavagem A (Tabela de Materiais) em RT em um frasco de Coplin. Coloque o frasco coplin em um agitador orbital definido para 60 rpm.
2. Coloque o slide sobre uma toalha de papel para deixar o tampão de lavar sair do escorregador e limpe suavemente as bordas. Prepare uma solução de 40 μL contendo sondas PLUS e MINUS (diluída 1:5 com diluente de anticorpos). Aplique a solução a cada espaço de 14 mm x 14 mm.
3. Incubar slides em uma câmara úmida por 1 h a 37 °C.

7. Ligação

1. Lave slides 2x para 5 min com 50 mL de 1x tampão de lavagem A em RT em um frasco coplin. Coloque o frasco coplin em um agitador orbital definido para 60 rpm.
2. Diluir o tampão de ligadura(Tabela de Materiais)1:5 com água ultrapura. Use este tampão para diluir aligase (Tabela de Materiais)1:40 para preparar um estoque de trabalho de solução de ligadura.
   1. Coloque o slide sobre uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem correr do escorregador e limpe suavemente as bordas. Aplique 40 μL da solução de ligadura para cada espaço de 14 mm x 14 mm.
3. Incubar slides em uma câmara úmida por 30 min a 37 °C.

8. Amplificação

NOTA: O uso de reagentes de detecção com fluoróforos vermelhos(Tabela de Materiais)resulta na menor quantidade de fundo no tecido C. elegans.

1. Lave slides 2x para 5 min com 50 mL de 1x tampão de lavagem A em RT em um frasco coplin. Coloque o frasco coplin em um agitador orbital definido para 60 rpm.
2. Diluir o tampão vermelho de amplificação(Tabela de Materiais)1:5 com água ultrapura. Use este tampão para diluir a polimerase(Tabela de Materiais)1:80 para preparar um estoque de trabalho da solução de amplificação e proteger da luz.
   1. Coloque o slide sobre uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem correr do escorregador e limpe suavemente as bordas. Aplique 40 μL da solução de amplificação para cada espaço de 14mm x 14 mm.
3. Incubar slides em uma câmara úmida por 1h e 40 min a 37 °C. Certifique-se de que a câmara úmida está coberta com papel alumínio para proteger as amostras da luz.

9. As lavadas finais

1. Lave slides 2x para 10 min com 50 mL de tampão de lavagem B (Tabela de Materiais) em RT em um frasco de Coplin. Coloque o frasco coplin em um agitador orbital definido para 60 rpm.
2. Lave slides 1x para 1 min com 50 mL de tampão de lavagem b em RT em um frasco de Coplin. Coloque o frasco coplin em um agitador orbital definido para 60 rpm. Este tampão é preparado diluindo o tampão de lavagem B com água ultrapura.

10. Montagem de deslizamento de cobertura

1. Deixe o tampão de lavagem em excesso passar o slide sobre uma toalha de papel e limpe qualquer tampão residual restante no perímetro revestido de epóxi do slide.
2. Adicione 10 μL de meio de montagem(Tabela de Materiais)para amostrar e colocar suavemente um deslizamento de cobertura na parte superior, permitindo que o meio de montagem se espalhe.
3. Pinte ao redor da borda do deslizamento de cobertura com esmalte para selar o deslizamento de cobertura e deslizar. Seja gentil com a aplicação de esmalte para evitar mover o deslizamento de cobertura, que danificará as linhas germinativas. Deixe o esmalte endurecer por pelo menos 20 min no RT, enquanto os slides são protegidos da luz, antes de vê-lo sob um microscópio.
4. Armazene slides em um recipiente escuro ou suporte de slides, pois as amostras com etiqueta PLA são sensíveis à luz. O fabricante sugere que os slides podem ser armazenados a -20 °C para armazenamento a longo prazo ou a 4 °C para armazenamento a curto prazo. Os slides preparados usando este protocolo durarão pelo menos 2 meses quando armazenados a 20 °C.

11. Aquisição de imagens

1. Para fins de quantificação, use um microscópio confocal para capturar imagens de germes extrudados que estão à vista, intactos e desobstruídos. Capture uma pilha z da germinação que abrange toda a germinação no plano z e gere uma imagem de projeção máxima para usar para quantificação.
   NOTA: A microscopia confocal é ideal para a obtenção e quantificação de imagens PLA com menor fundo em comparação com as obtidas usando um microscópio epifluorescente.
   1. Se a germinação não se encaixar em um campo de visão, capture os campos de visão sobrepostos conforme necessário para a imagem de toda a germinação. As projeções máximas dessas imagens podem ser costuradas em FIJI.
2. Certifique-se de manter as condições de imagem iguais entre o controle e as amostras experimentais para estabelecer um limiar justo e adequado para identificação de focos durante a análise da imagem.
   NOTA: Registre pelo menos 8-10 germes de cada amostra por réplica para facilitar a análise estatística da quantificação do PLA. Pelo menos três réplicas biológicas são recomendadas para o PLA obter resultados quantitativos confiáveis e consistentes.

12. Análise e quantificação de imagens usando FIJI/ImageJ

NOTA: O fluxo de trabalho a seguir é baseado em imagens adquiridas usando o objetivo de 40x em um microscópio confocal, no qual as imagens são salvas no formato .czi. Essas imagens .czi e seus metadados que acompanham, incluindo dimensões, podem ser acessadas e abertas em FIJI/ImageJ para análise suplementar. Deve ser verificado se o FIJI aceita o formato de arquivos confocais do confocal disponível para o usuário específico. Caso assim, as imagens no formato .tiff podem ser usadas alternativamente para análise, mas o usuário precisará definir a escala da imagem manualmente em FIJI/ImageJ (Analyze | Definir escala). Recomenda-se que todas as imagens de controle negativo sejam analisadas em conjunto primeiro para estabelecer o nível de fundo.

1. Inicie o fluxo de trabalho de análise analisando todas as imagens de controle negativo primeiro, depois passe para as amostras experimentais. Abra uma imagem de projeção máxima em FIJI/ImageJ para analisar (Figura 2A). Se usar um arquivo .czi, uma caixa Opções de importação de bioformatos será solicitada.
   1. Inclua as seguintes opções para abrir sua imagem: exibir pilha com navegador de dados; modo de cor = Colorido. Uma janela com a imagem deve agora abrir com uma barra de slides para alternar entre diferentes canais capturados por confocal (por exemplo, DAPI ou PLA).
   2. Se as imagens precisarem ser costuradas, crie duplicatas de cada canal de cada imagem selecionando a imagem com o mouse e selecionando Duplicar para abrir a janela Duplicada. Especifique apenas o número do canal (c) que corresponde ao canal PLA ou DAPI (por exemplo, 2) e desmarque a caixa para Hyperstack Duplicado.
   3. Com ambas as imagens a serem costuradas abertas, selecione Plugins | Costura | Preterido | Costura 2D. Uma janela de costura de imagens 2D será aberta. Selecione quais imagens serão usadas para costurar e use os parâmetros padrão que estão predefinidos na janela e selecione Ok. A imagem resultante será uma imagem em escala de cinza montada.
      NOTA: Se as sub-imagens não se alinharem perfeitamente, ajustando parâmetros (ou seja, aumentando o número de picos a serem verificados de 5 para 500 ou alterando o método de fusão de Mistura Linear para Max. Intensidade) pode ajudar a obter a imagem desejada. Enquanto outras ferramentas de costura estão disponíveis, essa abordagem mantém a dimensionalidade da imagem, que é importante para a quantificação.
2. Abra o gerenciador DE ROI (Região de Interesse) pressionando T no teclado. Uma nova janela chamada ROI Manager será aberta.
3. Selecione a ferramenta polígono na caixa de conjunto de ferramentas FIJI. Pontos de queda ao redor da linha germinal para esboçá-lo e gerar um ROI (Figura 2B). Conecte o último pontos ao primeiro para gerar um ROI completo.
   NOTA: Para imagens mais escuras, é útil ajustar o contraste para melhorar a visibilidade da germinação (que é reversível) para que possa ser delineada com mais precisão.
   1. Imediatamente após concluir o ROI, vá até o gerenciador de ROI e selecione Adicionar [t] para armazenar o ROI. É imprescindível que quaisquer alterações no ROI, incluindo aadição/remoção de pontos ou movimento do ROI e pontos sejam atualizados (selecione Atualização do gerenciador de ROI) antes de prosseguir para a próxima etapa, ou eles serão perdidos. Mais detalhes sobre a manipulação de ROIs e seus pontos podem ser encontrados no Guia do Usuário FIJI/ImageJ.
4. Uma vez definida a orientação do ROI, ela pode ser salva para referência posterior selecionando o nome ROI no gerenciador de ROI seguido por Mais | Salvar | (arquivo de nome e especificar destino para onde salvar). ROIs salvos podem ser abertos no gerenciador de ROI selecionando Mais | Aberto | (selecione o arquivo).
5. Meça a área dentro do ROI selecionando o nome DO ROI no gerenciador de ROI e, em seguida, selecionando o botão Medir no gerenciador de ROI. Uma janela resultados será aberta com informações sobre o ROI, incluindo a área que cobre na imagem (μM²) (inset da Figura 2B). Registre essas informações em uma planilha para cálculos subsequentes.
   NOTA: Certifique-se de que a escala da imagem foi definida corretamente para que as dimensões corretas do ROI sejam coletadas. Os tipos de medidas relatadas na caixa Resultados podem ser modificados indo para Analyze | Definir medidas....
6. Abra uma imagem duplicada apenas do canal PLA selecionando à direita a imagem PLA e selecionando Duplicação (Figura 2C). Uma janela duplicada será aberta. Especifique apenas o número do canal (c) que corresponde ao canal PLA (por exemplo, 2) e desfaça a caixa para Hyperstack Duplicado. Recomenda-se a duplicação desta imagem para que a imagem original não seja modificada.
   NOTA: Essas opções só aparecerão ao visualizar as imagens contendo vários canais no FIJI/ImageJ. Uma abordagem alternativa é dividir os canais Imagem | Cor | Dividir canais,mas isso modificará seu arquivo de imagem original.
7. Com apenas a imagem do canal PLA selecionada, vá para Image | Ajuste | Limiar. Uma janela limiar para a imagem será aberta. Selecione Padrão como o método limiar, Vermelho como a cor e marque a caixa de fundo Escuro. Usando a faixa superior na janela, deslize a barra para a direita até que todos os focos de PLA estejam claramente destacados na imagem.
   1. Registre o valor na caixa à direita da faixa superior e tome nota de qual valor foi usado para definir o limite. Selecione Aplicar na janela Limiar para finalizar o limiar, e a imagem será convertida em um fundo branco com apenas os focos de limiar visíveis como pontos pretos(Figura 2D). Teste o limiar em várias imagens de controle negativo para garantir que seja apropriado para capturar todos os focos pla de imagem para imagem antes da quantificação.
      NOTA: Para visualizar os focos limiares como pontos pretos no fundo branco, vá para Process | Binário | Opções... e desmarque a caixa de fundo Preto. Um valor limiar entre 30-40 é um bom ponto de partida para identificar pla na linha germinal; no entanto, o valor ideal pode variar dependendo do fundo.
8. Para quantificar os focos do PLA, aplique o ROI gerado das etapas 12.3-12.3.1 para a imagem limiar selecionando o nome ROI na janela do gerenciador de ROI. O contorno do ROI deve aparecer na imagem no mesmo local que era da imagem de origem(Figura 2E).
   1. Vá analisar | Analisar partículas. A janela Analisar partículas abrirá e selecionará os seguintes parâmetros: tamanho (micron^2) = 0-Infinity, circularidade = 0,00-1,00, mostrar = Nada. Verifique a caixa Resumir.
   2. Selecione Ok, e uma tabela de resumo aparecerá com informações sobre o ROI (ou seja, a contagem total de focos de PLA, área total ocupada pelos focos do PLA no interior do ROI, tamanho médio dos focos do PLA e percentual de área ocupada por focos de PLA em relação ao tamanho do ROI) (inset a Figura 2E). Registre essas medidas em uma planilha.
9. Repita as etapas 12.1-12.8 para várias imagens de controle negativo usando o mesmo limiar.
   1. Uma vez analisadas todas as imagens de controle negativo, repita as etapas 12.1-12.8 para todas as amostras experimentais utilizando o mesmo limiar que foi determinado pelo controle negativo para identificar e quantificar os focos de PLA.

Co-imunocoloração de ambos 3xFLAG::DLC-1; GFP e 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP germinas com anticorpos FLAG e GFP revelaram seus padrões de expressão na germinação (Figura 3Aii-iii, 3Bii-iii). Enquanto o GFP foi expresso em toda a germinação(Figura 3Aiii), a expressão OMA-1::GFP foi restrita ao pacitene tardio e aos oócitos(Figura 3Biii)²⁷. A imunocoloração flag mostra que 3xFLAG::DLC-1 foi expresso em toda a linha germinal em ambas as cepas (Figura 3Aii,3Bii). Ao co-imunostaining, a sobreposição entre 3xFLAG::DLC-1 e OMA-1::GFP é indistinguível daquela entre 3xFLAG::DLC-1 e GFP (controle negativo).

Uma vez que esses experimentos foram testados para interações entre o DLC-1 e o OMA-1, a região de interesse para quantificação de PLA na germinação abrangeu o pacitene tardio através dos oócitos em todas as germinas examinadas (Figura 2B), pois esta é a região da expressão OMA-1(Figura 1, Figura 3Biii). 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::As germinativas gfp pareciam ter uma maior quantidade de focos de PLA nesta região em comparação com o 3xFLAG::DLC-1; Germes GFP (Figura 3Ciii-iv,3Diii-iv). Quantificação do PLA revelou que o número de focos de PLA presentes em 3xFLAG::DLC-1; As germes OMA-1::GFP foram significativamente maiores que 3xFLAG::DLC-1; GFP (Figura 3Ciii-iv,3Diii-iv; Tabela 1). Além disso, mesmo com a diluição 10x maior dos anticorpos GFP e FLAG, a diferença entre o controle e o PLA experimental ainda era significativamente diferente; no entanto, a densidade geral e o tamanho médio dos focos foram reduzidos (Tabela 1).

Figura 1: Esquemático de C. elegans germinação. A região da ponta distal contém a piscina de células-tronco, que é seguida pelo pacitene meiotico, onde as células mudaram da mitose para a meiose. Células que saem do pacitene meiotico se desenvolvem em oócitos, com o oócito mais maduro na extremidade proximal. A região sombreada em verde, que abrange desde o pacitono meitico tardio através de todos os oócitos, representa o padrão de expressão OMA-1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens representativas do fluxo de trabalho para quantificação de PLA germinal. A germinação utilizada nesta figura é um representante 3xFLAG::DLC-1; Germinação GFP da Figura 3C. (A) Imagem dos canais PLA e DAPI mesclados abertos em FIJI/ImageJ. (B) A ferramenta de polígono em FIJI é utilizada para delinear e definir a região de interesse (ROI) na germinação (linha amarela com caixas brancas) quantificada, e a área do ROI (μM²⁾é medida (inset de B). (C) Uma única imagem do canal PLA é obtida duplicando ou dividindo a imagem original em (A,B). (D) O limiar é cuidadosamente definido para destacar distintamente todos os focos de PLA na imagem PLA. O mesmo limiar deve ser aplicado a todas as imagens experimentais e de controle que serão analisadas em conjunto. (E) Com o ROI selecionado na imagem de limiar, a função Analisar Partículas retornará uma tabela de resultados que inclui a contagem total de focos incluídos dentro do ROI (entrada de E). As imagens são instantâneos de FIJI/Image J: Plugins | Utilidades | Capture Image. Barras de escala = 10 μM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Imagens representativas de germes após co-imunocoloração ou PLA. (A,B) Os padrões de expressão das proteínas marcadas em 3xFLAG::DLC-1; GFP (Ai-iv) e 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::GFP (Bi-iv) foram avaliados em gônadas dissecadas, fixas e imunomaculadas. O anticorpo anti-FLAG foi usado em uma diluição de 1:1000, enquanto o anticorpo anti-GFP foi usado em uma diluição de 1:200, o que é ideal para imagens de imunofluorescência. O DNA foi manchado pelo DAPI, e o canal individual é mostrado em escala de cinza para melhor contraste (Aiv,Biv). Em cada imagem, as células-tronco e o paciliano meiotético são delineados com linhas tracejadas, enquanto os oócitos são delineados com linhas pontilhadas. As imagens foram adquiridas com um microscópio epifluorescente. Barras de escala = 10 μM.(C,D) PLA em 3xFLAG extrudado::DLC-1; GFP (C) e 3xFLAG::DLC-1; Gnades OMA-1::GFP (D). Anticorpo anti-FLAG foi usado em uma diluição de 1:1000, enquanto anticorpo anti-GFP foi usado em uma diluição de 1:4000. O DNA foi manchado pelo DAPI, e ambos os canais individuais da DAPI (Cii,Dii) e PLA(Ciii,iv, Diii,iv) são mostrados em escala de cinza para melhor contraste. A caixa verde e tracejada(Ciii,Diii)denota a localização das imagens pla ampliadas(Civ,Div). Em cada imagem, as células-tronco e o paciliano meiotético são delineados com linhas tracejadas, enquanto os oócitos são delineados com linhas pontilhadas. As imagens foram adquiridas com um microscópio confocal. As barras de escala = 10 μM. (A,B,C,D) foram todas montadas com software de processamento de imagem (ver Tabela de Materiais). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Resumo dos resultados do PLA. Tabela relatando um resumo da quantificação do PLA em duas diluições de anticorpo primário. As diferenças na densidade média do PLA ou no tamanho médio dos focos de PLA para OMA-1::GFP entre ambas as titulações de anticorpos não foram significativas (valor p não mostrado). A mesma comparação também foi aplicada ao GFP, o que também não resultou em diferença significativa (valor p não mostrado). Os valores p foram determinados utilizando-se um teste t de variância deduas caudas/igual.

Ao estudar ppis na germinação C. elegans, a maior resolução oferecida pelo PLA em comparação com a co-imunocoloração permite a visualização e quantificação dos locais onde ocorrem interações na germinação. Foi relatado anteriormente que o DLC-1 interage diretamente com o OMA-1 usando um ensaio de retirada GST in vitro ²⁶; no entanto, essa interação não foi recuperada por um pulldown in vivo. Co-imunocoloração fluorescente de 3xFLAG::DLC-1; OMA-1::Germlines GFP mostra uma sobreposição nos padrões de expressão para DLC-1 e OMA-1; no entanto, não há indicação de onde suas interações ocorrem na germinação, e a sobreposição em si não é maior do que entre 3xFLAG::DLC-1 e GFP que não se fundem a nenhuma proteína (controle negativo). Usando in situ PLA, verificou-se que o DLC-1 interage com o OMA-1 na linha germinal, o que sugere que o PLA pode ser mais sensível para detecção de PPIs em comparação com outras abordagens. Através desta abordagem continuamos a expandir sobre o papel emergente do DLC-1 como cofator rbp. Este trabalho demonstra a capacidade do PLA de detectar PPIs na germinação e estabelece uma referência para futuros usuários explorando as interações entre proteínas de seu próprio interesse.

O PLA oferece aos usuários a capacidade de testar ppis com sensibilidade comparável sem as desvantagens associadas a outras técnicas, como FRET e BiFC. Níveis biologicamente relevantes de expressão proteica podem não ser ideais para FRET e BiFC. Além disso, a função de potenciais parceiros de interação pode ser afetada pelas grandes tags usadas em ambas as abordagens. Além disso, os ensaios fret requerem uma configuração de microscopia especializada que pode não estar prontamente disponível. O PLA também pode ser uma abordagem econômica para estudar PPIs em comparação com outras técnicas. Os usuários só precisam obter reagentes pla e acesso a um microscópio confocal para imagens, além dos reagentes necessários para a imunocoloração. A análise de imagem é realizada usando o programa de código aberto FIJI/ImageJ, que está disponível para qualquer usuário sem nenhum custo. Os usuários que não têm experiência com FRET ou BiFC podem achar o PLA uma alternativa adequada. O protocolo aqui apresentado contém apenas várias etapas adicionais além de um procedimento típico de imunocoloração, tornando esta técnica virtualmente acessível a qualquer usuário com experiência de imunocoloração.

A extrusão da gonad por dissecção é importante para que o PLA funcione com sucesso. Os tecidos que são retidos dentro da cutícula do verme não são rotulados por PLA usando este protocolo. Verificou-se ainda que os embriões extrudados são efetivamente rotulados por este protocolo PLA. Isso sugere que outros tecidos que são liberados durante a dissecção, como o intestino, também são compatíveis com pla. Verificou-se que o PLA produz sinais robustos em gônada, bem como amostras de embriões preparadas com dois protocolos de fixação que são frequentemente usados para imunocoloração. Isso sugere que os procedimentos adicionais de fixação utilizados no campo podem ser compatíveis com o PLA, mas precisarão ser avaliados individualmente pelo usuário.

Determinar a diluição ideal dos anticorpos primários é fundamental para o sucesso do PLA. É melhor começar com a diluição que foi otimizada para a imunofluorescência. Isso é tipicamente conseguido pela titularidade do anticorpo primário em um experimento de imunofluorescência para encontrar a diluição ideal onde há baixo fundo e um sinal alto e específico. Uma vez estabelecidas as diluições ideais para a imunofluorescência, essas mesmas diluições podem ser testadas em um ensaio PLA que compara o sinal produzido por um par de interatores potenciais ao sinal produzido por um par de proteínas não interagindo.

No caso em que o sinal abundante é observado na amostra de controle, é necessária uma diluição adicional dos anticorpos primários. Verificou-se que as diluições primárias de anticorpos ideais para PLA são pelo menos as mesmas ou até mais diluídas do que as usadas para imunofluorescência. Por exemplo, as imagens de imunofluorescência na Figura 3A,B são representativas de uma diluição 1:1000 de anti-FLAG e uma diluição de 1:200 de anti-GFP. No entanto, as diluições de anticorpos em imagens PLA na Figura 3C,D foram 1:1000 de anti-FLAG e 1:4000 de anti-GFP. A diluição do anticorpo anti-GFP usado no PLA é maior do que o que foi usado para a imunofluorescência, sugerindo que o PLA é muito mais sensível. Verificou-se que a diluição de anticorpos 10 vezes resultou ainda em uma redução da densidade do PLA, bem como o tamanho dos focos De LDL-1/OMA-1(Tabela 1). Apesar dessa redução, a diferença na densidade do PLA entre o controle negativo e o DLC-1/OMA-1 ainda era significativamente diferente. Isso sugere que o PLA ainda é muito sensível com diluições mais elevadas de anticorpos primários; no entanto, a prevalência de interações detectáveis será subestimada.

Em contraste, uma diluição muito baixa de anticorpos pode ter dois tipos de consequências prejudiciais. Primeiro, pode produzir um sinal de fundo significativo no controle negativo. Em segundo lugar, os focos de PLA produzidos pelas proteínas parceiras interativas podem se fundir e se sobrepor, tornando-os difíceis de resolver em uma imagem de projeção máxima. Isso leva a uma subestimação do número de focos de PLA e densidade durante a análise de imagens. O sinal PLA é um equilíbrio de detectar proximidade espúria entre parceiros não interagindo e detectar todas as instâncias de PPIs reais que ocorrem na amostra. Como resultado, a incorporação de um controle negativo onde duas proteínas não interagem é essencial para determinar o nível de fundo em experimentos de PLA. A omissão de um anticorpo primário em um experimento PLA tem sido usada como controle negativo em outros relatórios^9,10; no entanto, essa abordagem não pode explicar interações não específicas ou vinculação de anticorpos não específicas que possam impactar o resultado no PLA experimental. O GFP foi utilizado aqui como um controle negativo, uma vez que não era esperada interação direta entre DLC-1 e GFP. Descobriu-se que o controle negativo tinha algum sinal de fundo. Isso corrobora ainda mais a importância de um controle negativo para um ensaio pla na avaliação dos dados experimentais.

Uma vez estabelecidas diluições otimizadas pelo PLA, essas diluições podem ser usadas para testar em uma variedade de diferentes cepas de worms que contêm diferentes pares de parceiros de interação marcados com as mesmas tags de afinidade. É importante usar o mesmo par de anticorpos primários para garantir uma comparação justa dos sinais pla resultantes, uma vez que a variação na afinidade de anticorpos pode afetar o resultado de um experimento PLA. Outro relatório sobre pla sugere a otimização da diluição dos anticorpos secundários PLA¹⁰; no entanto, isso não é recomendado. Diluições mais elevadas de anticorpos secundários podem reduzir a eficácia das outras etapas de PLA a jusante que dependem do reconhecimento de sondas PLUS e MINUS que são conjugadas aos anticorpos secundários.