Безмаркеров удаление генов Флексед Кассета Аллелик Обмен Мутагенез в chlamydia trachomatis

Хламидиоз трахоматис является основной причиной бактериальных заболеваний, передающихся половым путем, и представляет собой значительное бремя для здоровья человека. Более 100 миллионов человек заражаются каждый год c. trachomatis¹. Приблизительно 70% инфекций у женщин протекают бессимптомно, несмотря на пагубные последствия для репродуктивного здоровья, такие как воспалительные заболевания таза, внематочная беременность и/или бесплодие. Сиквелы болезни напрямую связаны с иммунопатологией, инициированной инфекцией C. trachomatis ^2. Эффективная вакцина еще не разработана; поэтому понимание функции бактериальных факторов вирулентности и других продуктов бактериального гена является важным и срочным исследовательским вопросом.

Как внутриклеточные бактерии, вторжение клеток-хозяев, внутриклеточная репликация, высвобождение потомства и уклонение от иммунологических реакций хозяина являются критическими процессами. C. trachomatis образует паразитофорную мембрану, связанную вакуолой, называется включение, для внутриклеточного развития. Создание включения и многих других критических процессов достигается путем секреции белков-эффекторов через систему секреции типа III (T3SS)^3. Выяснение функций этих секретируемых эффекторов было ограничено в течение многих лет из-за генетической неразрешимости C. trachomatis. В отличие от кишечной палочки,многие классические методы клонирования не применимы к хламидиозу. Несколько основных ограничений включают эффективность преобразования, отсутствие контротбора репортеров, таких как sacB, и плазмидное обслуживание. В то время как E. coli плазмиды, как правило, поддерживается на неопределенный срок с происхождением репликации и соответствующего селективного давления, C. trachomatis плазмиды требует дополнительных восьми открытых кадров чтения(pgp1-8) для обслуживания, которые находятся на родном pL2 плазмида в L2 serovar⁴.

В последние годы было несколько генетических инструментов, созданных, которые вмещают уникальной биологии Хламидия, но Есть еще ограничения^5,6,7. Химический мутагенез с помощью этилового метанасульфоната (EMS) лечение может привести к неправильной мутации, или (менее часто) может привести к нуклеотидных переходов введения преждевременной остановки кодон, чтобы дать нонсенс мутации⁸. Транспосона вставка эффективна для нарушения генов, но современные технологии в исследованиях хламидиоза трудоемкие и отнимают много времени⁹. Как методы лечения EMS, так и методы транспозогенеза генерируют случайные мутации и требуют строгих методов скрининга для изоляции штаммов мутантов. Метод нарушения генов путем вставки интронов группы II (например, TargeTron) позволяет направлять мутагенез; однако, этот метод ограничен эффективностью, и место вставки не всегда правильно предсказано¹⁰.

Флуоресценция сообщили аллельский обмен мутагенез (FRAEM) является стратегия, используемая для целевого удаления генов в сочетании с вставкой выбора кассеты предоставления устойчивости к антибиотикам и флуоресценции репортер¹¹. Тем не менее, FRAEM осложняется потенциалом вызванных кассетами полярных эффектов на нисходяизны гены, особенно при ориентации генов в полицистронных оперонов. Floxed кассета аллельный обмен мутагенез (FLAEM) является новый генетический подход, разработанный для облегчения кассеты индуцированных полярных эффектов, ранее наблюдалось с FRAEM выбор кассеты¹². FLAEM использует редактирование генома Cre-loxP для удаления кассеты выбора и восстановления экспрессии низшихих генов. Отборочная кассета, содержащая устойчивость к антибиотикам и зеленый флуоресцентный белок (GFP), перестроена с фланговыми участками локса. Эти локс-сайты могут рекомбинироваться в присутствии рекомбиназы Cre и привести к иссечению кассеты из генома¹³. Эта стратегия была показана, чтобы облегчить кассеты индуцированных полярных эффектов при ориентации tmeA для удаления^12,14.

Оба метода FRAEM и FLAEM используют один и тот же вектор самоубийства, pSUmC 4.0, который может быть условно поддерживается через индуцируемое выражение pgp6. Выражение pgp6 ранее было показано, что необходимо для удержания плазмида и поэтому используется для контроля плазмидобслуживания обслуживания^11,15. Когда C. trachomatis выращивается в средствах массовой информации, дополненной анигэсустететециклин (aTc), чтобы вызвать выражение pgp6, вектор сохраняется. При отсутствии aTc вектор теряется. Целенаправленное удаление гена достигается путем аллельного обмена гена для селекционной кассеты. 3 кб регионов непосредственно вверх по течению и вниз по течению целевого гена служат в качестве гомологии оружия для рекомбинации. Эти руки клонируются в вектор pSUmC 4.0, обрамляющий кассету выбора. Успешная трансформация C. trachomatis и рекомбинационные события наблюдаются через флуоресцентную отчетность. Выражение mCherry на векторном позвоночнике и gfp в пределах выделенной кассеты дает красные и зеленые флуоресцентные включения. Как только aTc извлекается от средств культуры, зеленые-только включения показывают успешно случаи рекомбинации с потерей вектора суицида и интеграции кассеты выбора в бактериальный геном.

FLAEM представляет собой расширение FRAEM через последующее преобразование рекомбиназы-выражения вектор, pSU-Cre, в недавно созданный штамм мутантов. Рекомбиназа крема облегчает рекомбинацию между участками loxP и иссечение кассы выбора. События рекомбинации указываются с помощью флуоресценции. Вектор ПГУ-Кре кодирует mCherry; таким образом, успешное преобразование указывается добавлением красной флуоресценции в gfp-выражениевключений. Культивирование при отсутствии селективного давления для кассеты приводит к рекомбинации cre-опосредованности на участках loxP, а потеря кассеты указывается только красными включениями. Как и в pSUmC-4.0, индуцируемое выражение pgp6 используется для условного поддержания pSU-Cre. Как только aTc и выбор антибиотика извлекаются, плазмида вылечена, и результирующее немаркерный штамм удаления нефторный. Этот метод решает проблему вызванных кассетами полярных эффектов.