Kontrollerad Lukt Mimic Genomsmetering System för Luktträning och Fältprovning

Olfaction är en avgörande, men ofta förbisedd, avkänningsmekanism som används av de flesta djur. För många är det den viktigaste mekanismen för att lokalisera mat, hitta en kompis, eller avkänning fara¹. Dessutom är luktkapacitet vissa djur, framför allt hundar, regelbundet utnyttjas av människor för att upptäcka smuggelgods (t.ex., narkotika eller sprängämnen), eller andra föremål av intresse, såsom saknade personer, invasiva arter, eller sjukdomar^2,3. För hund detektion forskning eller andra olfaction forskningsämnen, prövare studerar ofta processen för olfaction och styrkor och begränsningar i luktsystemet. Som sådan är det allmänt önskvärt att kontrollera utsläpp av en luktgasa i miljön för att reproducera leverera kända mängder av luktämne under testning. Underlåtenhet att redogöra för variationer i lukt tillgänglighet på grund av faktorer som ångtryck eller miljöeffekter ofta komplicerar data tolkning och tillämplighet⁴. Det är på samma sätt önskvärt att ge en etablerad mängd lukt under utbildning scenarier för detektering av hundar. Till exempel studier av Hallowell et al.⁵ och av Papet⁶ har indikerat vikten av luktintensitet i luktuppfattning, och att förändra intensiteten hos en luktant kan påverka hur det uppfattas ensamt eller i en blandning.

I laboratorieinställningar, användning av analysutrustning såsom permeation rör med kontrollerbara ugnar, ånggeneratorer, eller olfactometers kan användas för att kontrollera lukt leverans. Denna typ av utrustning är dock opraktisk för användning under fälttest och träningsscenarier⁴. Den kontrollerade lukt Mimic Permeation System (COMPS) utvecklades som en enkel, låg kostnad, och engångsmetod för kontrollerad lukt leverans kräver ingen extern ström. Därför kan de lätt införlivas i en mängd olika testnings- och träningsscenarier⁷. COMPS-enheter är helt enkelt består av en luktant av intresse på ett absorberande material förseglat inuti en permeabel polymerpåse, lagras i ett sekundärt inneslutningssystem. Utnyttjandet av COMPS minskar variabiliteten mellan testerna och förbättrar konsekvensen under träningsövningar⁸.

Lukt leverans eller tillgänglighet från COMPS mäts i termer av permeation rate, som bestäms av gravimetrisk analys i form av massa av ånga som frigörs över tiden. Permeationshastigheter kan kontrolleras av ett antal faktorer, bland annat tjockleken på polymersäcken, dess tillgängliga yta, typen av absorberande material (substrat) som används, och mängden av luktämnet. Permeationshastigheten är konstant under en given tidsperiod (timmar eller dagar) beroende på vilken luktämne som används. Detta möjliggör minimal variabilitet i lukt leverans under testning eller utbildning. Under lagring, COMPS kommit till jämvikt inom den ogenomträngliga yttre behållaren, vilket resulterar i en omedelbar källa till luktig ånga med en känd permeationhastighet.

COMPS var ursprungligen utformade för att innehålla luktämnen i samband med explosiva material och för att användas som lukt härmar⁷. Som definieras av Macias et al., en lukt härma simulerar ett material av intresse, såsom en explosiv, genom att ge den dominerande flyktiga föreningar, eller luktämnen, som finns i headspace av detta material utan närvaro av modermaterialet själv⁸. För att skapa en lukt härma, måste de aktiva luktämnena i föräldramaterialet bestämmas. En aktiv lukt, i detta scenario, beskrivs som en flyktig förening som en utbildad explosiv-upptäckt hund upptäcker, tro att det finns en verklig explosivt material närvarande. Efter att ha identifierat dominerande flyktiga föreningar i headspace av flera explosiva material, comps var beredda att släppa dessa enskilda luktämnen i en kontrollerad takt under den tid som hund olfactory upptäckt fältförsök och fastställa den aktiva luktämnet är associerad med flera explosiva material. COMPS användes framgångsrikt för detta ändamål⁷,^{9 och}har sedan använts som lukt härmar för ytterligare explosiva upptäckt utbildning.

Macias et al. utnyttjade COMPS som innehåller piperonal, en ren kemisk fast vid rumstemperatur som, i ångfasen, har visat sig vara den aktiva luktämne för MDMA (3,4-metylendioximetamfetamin), den psykoaktiva drogen kallas ecstasy. Forskarna använde varierande tjocklekar och ytområden av lågdensitetspolyetenpåsar för att justera permeationshastigheten av piperonal ånga. Denna serie av COMPS användes sedan för att uppskatta piperonal detektionströskel för utbildade narkotika-upptäckt hundar⁸. Omvänt, i en separat studie, COMPS väska tjocklekar justerades för att minimera avvikelsen av permeation priser mellan varje förening i en homolog serie även om de besatt drastiskt varierande ångtryck. Om en enda påse tjocklek hade använts i denna studie, de föreningar med högre ångtryck skulle ha gett mycket högre permeation priser. Genom att öka påsens tjocklek för de högre volatilitetsföreningarna justerades permeationshastigheterna så att de var likartade för alla föreningar⁴. Båda studierna visar nyttan och anpassningsförmågan hos COMPS för att kontrollera ångutlösning. Liknande studier optimera polymer påsen tjocklek samt absorberande material har utförts i skapandet av lukt härmar för syntetiska katinoner (dvs, badsalt)¹⁰, andra narkotika (inklusive heroin och marijuana¹¹), och mänsklig lukt föreningar^12,13. I ett sista exempel undersökte Simon et al. de aktiva luktämnen som är associerade med en invasiv svampart¹⁴. Hela bitar av infekterade träd bark, i stället för de extraherade luktämnen, placerades direkt i polymerpåsen för att kontrollera release under hund olfaction testning¹⁴. COMPS kan utnyttjas för en mängd olika scenarier, och de protokoll som diskuteras häri valdes för att visa mångfalden av detta verktyg.

1. Montering av COMPS (figur 1)

1. För nätt (flytande) förening på ett substrat (Bild 1A)
   1. För att impregnera substratet med odorant, använd en kalibrerad pipett för att lägga till 5 μL nätt förening till en 2 x 2 tums bomull gasväv pad eller annat substrat val (se Tabell of Materials).
   2. Vik gasväv pad på mitten och placera denna (eller ett alternativt substrat material) i en 2 x 3 tum låg densitet polyeten permeabel påse. De föreslagna påstjocklekar är mellan 1 MIL, för den snabbaste genomsläppningshastigheten, till 8 MIL, för en långsammare permeationshastighet.
      OBS: Variationer i absorberande material, permeabel påsstorlek, polymerkemi och tjocklek kan användas, men dessa förändringar påverkar genomsmetringshastigheten hos luktämnena (se vidare diskussion i resultatsektionen).
   3. Omedelbart försegla polymerpåsen stängd med en värmeförstätare, vilket eliminerar så mycket luft inifrån påsarna som möjligt.
   4. Förvara påsen i en yttre nonpermeable väska, eller om den kommer att användas omedelbart, placera den i en ren väga båt i en rök huva (Figur 1B).
2. För fast material behövs inget substrat (Figur 1C)
   1. Väg den önskade mängden fast material, som kan vara en ren förening eller faktiskt målmaterial, och placera i en 2 x 3 tum lågdensitetspolyeten (LDPE) permeabla påse. Återigen, den föreslagna påsen tjocklek varierar från 1 MIL till 8 MIL.
   2. Omedelbart värme-täta polymerpåsen stängd, eliminera så mycket luft inifrån påsen som möjligt, och lagra eller ställ åt sidan i en väga båt.

2. Gravimetrisk analys för att bestämma COMPS-permeationshastighet

OBS: En konstant omgivningstemperatur är viktig för noggranna och reproducerbara mätningar, både gravimetriska och headspace. En konstant temperatur måste bibehållas under all provning. Det rekommenderas att utföra alla analytiska mätningar vid önskade temperaturer under provning.

1. För att bestämma genomsläppningsgraden för luktämnena genom den genomsläppliga väskan, placera en nygjord COMPS i en vägbåt inuti en draghuva.
2. Placera en ren, separat väga båt på en analytisk balans, och noll balansen.
3. Ta bort COMPS från draghuven och placera på saldot. Spela in massan och omedelbart återvända till rökkåpan.
4. Fortsätt att registrera massan av COMPS över regelbundna tidssteg tills massan av COMPS inte längre ändras (±5%). Vid denna punkt lukt från COMPS är uttömda.
5. Som en negativ kontroll, skapa en tom COMPS bestående av bara substratet material utan luktämnen förseglade i den genomsläppliga påsen. Behandla denna negativa kontroll på samma sätt som COMPS med odorant för att säkerställa minimala variationer i massa över tid.
6. Beräkna permeationshastigheten från COMPS.
   1. Rita massan av COMPS kontra tid på en X-Y tomt i lämpliga statistiska analys programvara.
   2. Montera en linjär trendlinje till bara den linjära delen av grafen och visa en ekvation på ett diagram. Trendlinjen ska INTE ställas in så att ursprunget ingår. Lutningen på linjen (dvs. m i y = m+ b) är permeationshastigheten i massa per tid per enhet.

3. Headspaceanalys genom mikrouttämning av fast fas med gaskromatografi/masspektrometri (SPME-GC/MS) (tillval)

1. Förbered en färsk COMPS efter instruktionerna ovan och låt den jämvikt i en öppen väga båt insidan av en rök huva i 30 min.
2. Ta bort COMPS från väga båten, placera den i en 1 pint epoxi-fodrad metall provbehållare utan lock, och lägg den i en 1 gallon epoxifodrad metallbehållare. Behållarna bör förvaras i en rökhuv under hela försöket.
3. Låt minst 30 min för jämvikt i behållaren före provtagningen.
4. För provtagning efter jämvikt, placera ett lock med ett tidigare borrat 1 cm hål ovanpå den yttre behållaren. Sätt in en lämplig SPME fiber genom hålet på locket för att extrahera analyt av intresse. När SPME-fibern inte används, täck hålet med paraffinfilm eller liknande. Utvinningstiden och fiberbeläggningen kommer att vara beroende av typ och mängd av analyt ånga närvarande, liksom storleken på provtagningskärlet och miljöförhållanden¹⁵.
5. Ta bort SPME fiber efter den tilldelade extraktionstiden och placera i det uppvärmda inloppet till en GC/MS för termisk desorption och analys.
   1. Kör den GC/MS-metod som är lämplig för den förening som används i COMPS¹⁶.
6. För kvantisering, jämför det resulterande toppområdet med en extern^{kalibreringskurva 16} och/eller intern standard¹⁷ enligt vad som är lämpligt för metoden och experimentell design.
   OBS: 1) I detta exempel användes epoxifodrade metallprovbehållare, men andra typer av behållare skulle också vara lämpliga. För att direkt jämföra lukt tillgänglighet till fält olfactory utvärderingar, skulle det vara bäst att använda samma behållare, rengöras mellan varje test, för båda experimenten; 2) För reproducerbara resultat bör alla aspekter av provtagningsförfarandet bibehållas i alla replikatexperiment, inklusive men inte begränsat till jämviktstid, SPME-utvinningstid, containertyp och storlek samt miljöförhållanden (dvs. temperatur och fuktighet).

4. COMPS-lagring

1. Placera en enda COMPS i en metaliserad barriärpåse (3,5 x 4,5 tum) och värme-tätning för att stänga, ta bort så mycket luft som möjligt från påsen före försegling (Bild 1B).
2. Förvaras i svala omgivnings- eller kylförhållanden men inte under eller nära fryspunkten för att undvika att kondens bildas när COMPS tinar.
3. Om testning av flera luktämnen eller odorant leveranshastigheter i ett enda experiment, rekommenderas sekundär inneslutning för att eliminera eventuella korskontaminering under transport och lagring.
   1. Placera replikat flera barriär påsar vardera innehåller enskilda COMPS av samma analyte och permeation hastighet i en yttre, större metalized väska eller glasburk för lagring och transport.

5. Provning av lukt på fältet

OBS: Lukttestning kan utföras på många olika sätt beroende på vilket djur som testas, målet med försöket, och miljöförhållandena. Protokollet nedan beskriver ett sådant sätt att testa. Alla djurförsök bör först granskas och godkännas av en kommitté för vård och användning av 1999 -1999 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC).

1. Först skapar tom eller negativ kontroll COMPS enligt beskrivningen ovan. Gör tillräckligt så att varje behållare i testscenariot kommer att innehålla reserv-COMPS (2–3 beroende på antalet djur som deltar i experimentet). Paketera alla blanka COMPS tillsammans i sekundär inneslutning (dvs. en större metalliserad påse eller glasburk med tätningslock).
2. Skapa färska COMPS efter behov för det avsedda fälttestprotokollet. Eliminera alla möjliga källor till kontaminering mellan COMPS och den metalliserade påsen. Detta kan åstadkommas genom regelbunden byte av handskar och rengöring av laboratoriet arbetsytan.
3. Förvara COMPS:en i minst 1 dag före användning för att möjliggöra jämvikt. Lagra eventuella replikat i samma sekundära behållare. Olika COMPS bör dock finnas i separata sekundära behållare.
4. Om du vill ställa in ett grundläggande luktprov för hund, lägg ut flera rader med minst fem identiska behållare (t.ex. metallburkar, lådor), med antalet linjer som är beroende av antalet variabler som testas.
   1. Ställ in utvärderingsversionen så att varje rad innehåller en behållare med mål-COMPS och fyra med blanka COMPS. Positiva kontrolllinjer, som förberetts på samma sätt men med en känd mållukt, kan användas på lämpligt sätt för experimentet, utbildning eller testning scenario. En ytterligare negativ kontroll eller tom rad bör innehålla fem tomma COMPS och inga mål. Beställ denna negativa kontrolllinje, positiv kontrolllinje (om du använder) och testa rader på måfå, och ändra ordning med hjälp av en slumpgenerator för varje hund lukttest som praktisk för testning scenariot.
      1. Inkludera en distraktor odorant / material per linje också.
      2. Randomisera ordningen och placeringen av målet och distraktor lukt i varje rad för varje hund som testas med hjälp av ett slumpmässigt nummer generator.
5. För att förbereda behållarna, ta bort COMPS från de sekundära och yttre behållarna, placera endast den genomsläppliga påsen i försöksbehållaren.
   1. Låt KOMPENSen ekviloverka i behållaren i minst 30 min före provning.
   2. Upprepa steg för varje COMPS som används i testet, börjar med ämnen, följt av positiva kontroller (om du använder), och sedan testa luktämnen, byta handskar varje gång.
      OBS: Detaljerade exempel på hund testning scenarier finns i Simon et al.⁴ eller Macias et al.⁸.

Det primära målet med att använda COMPS i lukttestning/utbildning är att kontrollera frisättningen av de valda luktämnena och leverera en kontrollerad mängd av luktämnet under test- eller träningspassets varaktighet. Odorant release mäts genom gravimetrisk analys i form av massförlust per enhetstid. Figur 2 ger ett exempel på gravimetriska resultat från genomsläppningen av tre identiska COMPS som beretts från 5 μL pentanosyra på bomullsgasväv genom en 3 MIL LDPE-påse. En linje av regression lades till grafen, och lutningen på linjen representerar permeationshastigheten på 37 μg/min för denna uppsättning comps.

Det är ofta önskvärt att kunna justera mängden odorant som frigörs för ett givet test. Detta kan göras på flera sätt, inklusive justering av mängden material i påsen, ytan av den genomsläppliga påsen materialet, eller påsen tjocklek. Bild 3 visar hur alla tre av dessa faktorer användes för att kontrollera frisättningen av piperonal. Bild 3A anger ett logaritmiskt samband mellan massan i piperonal i den genomsläppliga påsen (3 x 3 tum, 2 MIL LDPE), där permeationshastigheten ökade snabbt vid de lägre massorna, sedan bromsades efter 500 mg på grund av fysisk begränsning i mängden odorant som kunde frigöras från den givna påsen åt gången. Uppgifterna i figur 3B avbildar ett linjärt samband mellan permeationshastighet och yta i den genomsläppliga påsen för 2 g piperonal i en 2 MIL LDPE-påse. Slutligen minskade permeation hastighet linjärt med ökad påsen tjocklek (2 g piperonal i en 3 x 3 tums påse), som visas i figur 3C, eftersom den tjockare påsen begränsar och saktar utsläpp.

I ett annat exempel på nyttan av att kontrollera permeation priser, Simon et al.⁴ används väska tjocklek för att standardisera permeation priser för föreningar av varierande ångtryck för att presentera hundar med liknande luktig tillgänglighet för varje analyte under fälttestning. En volym på 5 μLs av varje nätt analyte var pipettered på separat bomull gasväv kuddar och placeras i 2 x 3 tum LDPE permeabla påsar. Permeationsgraderna mättes med gravimetrisk analys. Figur 4 visar variationen i ångtryck (figur 4A) över grupperna av analyter (RSD = 138%) jämfört med variationen i permeationshastigheten efter justering av påstjälckleken (Figur 4B) för att kontrollera hastigheten och göra dem så lika som möjligt (RSD = 31,8%). Vidare, justering av påsens tjocklek får permeation priser variera med tre storleksordningar (Tabell 1).

Headspace mätningar kan användas för att bättre mäta mängden odorant tillgänglig under en viss testning eller utbildning scenario. Macias¹⁸ mätte mängden piperonal i headspace av tre COMPS med permeationshastigheter på 1 000, 100, och 10 ng/min (Figur 5). DEN COMPS placerades i en 1 kvart provtagning kan, och headspace extraherades för 30 min med hjälp av SPME. Den resulterande kromatografen i figur 5 visar piperonala toppområden ökar med ökande permeation rate¹⁸.

Macias använde sedan dessa tre uppsättningar piperonal COMPS i hund försök. Utbildade narkotika upptäckt hundar testades på 0 (blank), 10, 100, och 1.000 ng / s piperonal COMPS i en doft bur (Tabell 2). Resultaten visade att eftersom permeation hastigheten, och därmed lukt tillgänglighet, ökade antalet hundar varna för lämpliga COMPS ökade¹⁸.

Figur 1: Exempel på COMPS. (A) En COMPS konstruerad av en bomull gasväv pad i genomsläpplig polymer väska. Reproduceras från Simon et al.⁴ ( B )EnCOMPS in i en yttre ogenomtränglig påse. (C) En COMPS som innehåller infekterat trä som luktkälla i en polymerpåse. Figurerna B och C återges med tillstånd från Simon et al.¹⁹. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 2: Exempelmätning av permeationsgrad genom gravimetrisk analys. Massförlusten av analyten (dvs. pentanosyra) på gasbinda genom en 3 MIL LDPE-påse mätt över tiden. A, B, och C anger replikat av samma material, medan "Genomsnitt" är det genomsnittliga värdet för de tre vid varje tidpunkt. Den givna ekvationen beskriver den linjära passformen till de genomsnittliga data. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 3: Exempel på faktorer som justerar permeationsgraden. Grafer av piperonal avledning indikerar experimentellt uppmätta permeationshastigheter vid byte av (A) massan piperonal (3 x 3 tum, 2 MIL LDPE-påse), (B) ytan på den permeabla påsen (2 g piperonal, 2 MIL LDPE), och (C) påsens tjocklek (2 g piperonal, 3 x 3 tums påse). Alla felstaplar representerar en standardavvikelse för medelvärdet (vissa staplar ligger inom markörens storlek). Dessa siffror har återges med tillstånd från Macias et al.¹⁸. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 4: Jämförelse av ångtrycksvariation över en grupp föreningar jämfört med variation av permeationshastighet. (A) Ångtryck för ett urval av 12 föreningar (RSD = 138%) jämfört med (B) permeationsgrad för samma föreningar med utvalda COMPS-tjocklekar (RSD = 31,8 %). Tal inom parentes representerar LDPE-påstjocklek i MIL. Dessa siffror har återges med tillstånd från Simon et al.⁴. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Figur 5: Headspace-analys av piperonal COMPS vid tre permeationstakt. Överlagrad kromatogram av headspace komponenterna i piperonal COMPS justeras till permeation priser på 1,000, 100, och 10 ng/s. Återges med tillstånd från Macias et al.¹⁸. Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.

Tabell 1: Genomsläppningsgrad kontra påstjocklek. Genomsmetningshastighet av metylbensoat på bomullsgasväv i COMPS av varierande påstjocklekar. Observera att den lägsta permeationshastigheten uppnåddes genom att placera en 4 MIL COMPS insidan av en metaliserad påse med en 1 / 8 i hål. R^2-värdet anger linjens passning till den gravimetriska observationsytan.

Tabell 2: Exempel på försöksresultat för hundfält. Hundsvar på piperonal COMPS med permeationsfrekvenser från 0–1 000 ng/s. Återges med tillstånd från Macias et al.¹⁸.

Controlled Odor Mimic Permeation Systems (COMPS) skapas enkelt genom att försegla en luktant av intresse i en genomsläpplig påse. Detta kan göras genom pipettering en snygg flytande förening på ett absorberande material och sedan placera det absorberande materialet i påsen; genom att placera en ren, fast förening direkt i påsen⁴, vilket gjordes i fallet med piperonal⁸; eller genom att sätta målmaterialet som innehåller flera eller okända luktämnen i en genomsläpplig påse, vilket gjordes med svampinfekterat trä¹⁴. Den genomsläppliga påsen styr frisättningen av luktämnet så att en känd och reproducerbar mängd kan levereras under en given utbildning eller testperiod. Genomseminateringshastighet mäts typiskt genom gravimetrisk analys, plottning av massförlust över tiden, och kan justeras genom att ändra ett antal parametrar, inklusive det absorberande materialet, massan/volymen av odorant, eller parametrar för permeationspåsen (dvs. tjocklek, yta eller polymertyp). COMPS lagras i ett yttre ickepermeabelt kuvert, vilket gör att KOMPLarna kan ekvilovilliga före användning, vilket ger en känd mängd luktämne omedelbart vid användning.

Ju större permeationshastigheten för en COMPS, desto större koncentration av luktant tillgänglig under en utbildning eller testning scenario. För att kvantifiera eller jämföra den luktkoncentration som avges från en COMPS bör headspace-analys av COMPS i test-/träningsbehållaren slutföras. Detta görs oftast genom att extrahera lukten med hjälp av SPME med analys av GC/MS. För kvantiserings- eller jämförelseändamål rekommenderas att man använder en intern standard och/eller en extern kalibreringskurva.

COMPS fungera som en låg kostnad, fält-amenable enheter för att styra frisättningen av en lukt för luktutbildning eller testning, till exempel med hunddetektorer. COMPS kan användas upprepade gånger fram till utarmning, varje gång leverera samma luktutsläppshastighet, även om den tid som utsläppshastigheten är konstant kommer att förändras för varje analyt och bör testas i laboratoriet före användning. Detta övervinner en allmänt erkänd begränsning av kontroll lukt leverans för fältbruk och förskott olfaction forskning och upptäckt djur utbildning.