아그로박테리움-형태유전자를 이용한 리칼시트 옥수수 근친선 미성숙 배아 변형 중재

1. 성장 매체 준비 이 프로토콜에 대한 정확한 성장 배지 레시피는 표 1을참조하십시오. 1L의 용지를 준비하기 위해 2L 비커를 볶음 판에 놓고 저어 바를 안쪽에 놓습니다. 900 mL의 증류수로 비커를 채우고 교반판을 켭니다. 교반 막대는 중간 속도로 회전해야 합니다. 모든 가루 성분의 무게를 측정하고 비커에 녹입니다. 모든 액체 성분(있는 경우)을 측정하고 비커에 넣습니다. 증류수를 사용하여 최종 부피를 1L로 가져옵니다. pH를 측정하고 레시피 사양에 맞게 조정합니다. 액체 성장 매체를 공식화하는 경우, 어떤 한천이 추가되지 않습니다. 필터 멸균기를 진공 펌프에 부착하고 필터를 통해 액체 성장 매체를 부어. 펌프를 켜고 모든 액체가 통과될 때까지 기다립니다. 용기에 캡을 놓고 라벨을 부착합니다. 고체 성장 배지를 공식화하는 경우, pH가 조정 된 후, 병이나 플라스크에 직접 한천을 추가합니다. 1L 액상 성장 배지를 2L Erlenmeyer 플라스크에 붓거나 1 L 오토클레이브 병 2개(각 500 mL)로 나눕니다. 두 병을 사용하는 경우, 한천을 분할하고 병에 직접 추가합니다. 스팀이 빠져나오도록 알루미늄 호일 2겹과 같은 통기성 커버로 플라스크를 덮습니다. 병을 사용하는 경우 상단의 나사 뚜껑을 느슨하게 덮습니다. 121 °C에서 25분 동안 오토클레이브. 오토클레이브 후, 오토클레이브에서 성장 매체를 제거하고 55-60°C로 냉각시(55°C로 설정된 수조는 이를 더 쉽게 만들 수 있습니다). 플레이트를 붓는 것이 편리할 때까지 성장 배지를 액체 상태로 몇 시간 동안 유지하십시오. 식힌 후 모든 살균 첨가제를 추가하고(표 1참조) 완전히 섞어줍니다. 모든 성분이 첨가 된 후, 라미나 흐름 후드에 선택한 용기에 지정된 볼륨을 부어. 성장 배지는 원하는 페트리 접시에 수동으로 부어질 수 있거나 액체 디스펜싱 장치를 사용하여 할 수 있다. 수동으로 부을 때, 취급의 용이성을 위해 더 작은 멸균 비커 (500 mL)에 오토 클레이브 매체의 큰 볼륨을 전송하는 것이 좋습니다. 성장 매체가 식고 굳어지도록 하십시오. 성장 매체는 일단 고체가 되면 사용할 수 있으며, 뚜껑이 있는 플레이트의 스택으로서 멸균 유동 후드에서 밤새 약간 건조한 후 다음날 사용하는 것이 가장 좋습니다. 하룻밤 건조 후, 플라스틱 슬리브로 접시를 전송, 느슨한 끝에 접어, 테이프의 작은 비트와 장소에 보관. 이것은 과도한 건조를 방지합니다. 배지는 시원하고 어둡고 깨끗한 환경(4-16°C)에 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. 2. 기증자 식물을 재배하고 미숙한 귀를 수확 토양이 없는 기판을 함유한 1.5갤런(5.9L) 냄비의 온실에서 공개적으로 이용 가능한 옥수수 근친교(즉, B73, Mo17 또는 W22)를 재배합니다. 낮에는 평균 기온이 25.5°C, 밤에는 20°C인 16/8(주/야간) 포토 기간을 사용하십시오. 식물은 필요에 따라 물을 주며, 제어 방출 비료 (15-9-12의 N-P-K)로 비료를 시비하며, 이는 토양 혼합물에 통합되거나 식재 후 표면에 첨가 될 수 있습니다. 그것은 일반적으로 귀가 나오기 위하여 종자 발아 후에 대략 70-90 일이 걸립니다. 귀 싹이 나오면, 통제되지 않는 수분이 발생하지 않도록 촬영 백으로 덮습니다. 실크가 나타난 후 약 2-3 일 후 꽃가루가 다음 날 사용할 수 있다면 70 % 에탄올로 살균 된 가위를 사용하여 실크를 잘라냅니다. 실크를 자르고 껍질 잎 의 끝 아래 약 2.5 cm 껍질을 자르고 실크가 나옵니다. 수분은 다음 날 수행 할 수 있습니다. 각 귀 사이에 가위를 다시 살균해야합니다. 술에서 아나더가 나오면 술가방과 미끄럼 방지 용지 클립을 줄기 주위의 가방 바닥에 덮습니다. 다음날 아침, 식물을 부드럽게 구부리고 가방을 두드려 꽃가루가 방출될 수 있도록 합니다. 술 봉투를 제거하고 꽃가루가 빠져나가는 것을 방지하기 위해 가방 의 상단을 접습니다. 그것은 일반적으로 가방 술 을 사용 하기 전에 1 일 (죽은 꽃가루와 창 고 anthers의 축적을 피하기 위해) 사용 될 것 이다. 신선한 꽃가루는 술에서 약 3-5 일 동안 수집 될 수 있습니다. 술의 기지에 있는 내부 꽃에서 anthers가 나올 때, 그 술은 아마 다음날 실행 가능한 꽃가루를 생성하지 않을 것입니다. 같은 식물 (자기)에서 꽃가루를 사용하거나 같은 근친 (시빙)의 다른 식물에서. 이어백을 제거하거나 가방 의 끝을 잘라 실크를 노출 한 다음 술 봉지에서 꽃가루를 실크에 빠르게 부어 넣습니다. 태슬 백으로 귀를 즉시 덮고 줄기 주위에 가방의 베이스를 고정하여 고정하십시오. 그것은 물리적으로 교차 수분을 방지 하는 데 도움이 수 분 동안 다른 유전자형의 꽃 식물에서 식물을 격리 하는 데 도움이 될 수 있습니다. 미숙한 귀가 수확 할 준비가 될 때까지 술 가방을 귀에 둡니다. 수분 후 9-12 일, 배아 크기에 대한 스크린 귀. 수분 봉투를 줄기 위로 밀어 귀를 노출시다. 껍질을 부드럽게 당겨 귀 둘레의 약 1/3에서 4분의 1, 귀 아래 거리의 약 1/3에 커널을 노출시십시오. 팁 근처의 커널은 평균 배아 크기를 나타내지 않습니다. 메스를 사용하여 크기와 색상의 다른 커널의 대부분과 유사한 단일 커널의 캡을 잘라내도록 합니다. 4.6단계에서 설명한 대로 주걱(눈금자)을 사용하여 배아를 제거합니다. 주걱 또는 디지털 캘리퍼스에 내장 된 눈금자를 사용하여 배아의 길이를 측정합니다. 배아가 1.5-2.0 mm 사이인 경우 귀를 수확하십시오. ~1.3 mm인 경우, 귀는 나중에 수확 할 준비가되어 있으며 약 7-8 시간에서 다시 확인할 수 있습니다. 3. 감염에 대한 아그로박테리움 현탁액 문화 를 준비 참고: PHP81430(도1)및 PHP7153912를 함유하는 아그로박테리움 균주 LBA4404(Thy-)는 -80°C에서 글리세롤 스톡으로 저장된다. 이러한 재료는 재료 이전 계약을 통해 코르테바 농업 과학에서 얻을 수 있습니다. LBA4404(Thy-)는 성장 매체에 공급되는 티미딘을 필요로 하는 보조영양균입니다. auxotroph 아그로 긴장의 1 차적인 유틸리티는 생물 봉쇄 목적을 위한 것입니다. 그것은 농업 과성장을 감소의 추가 혜택. 보조 영양 아그로 균주는 보충 티미딘없이 성장하지 않습니다. 그럼에도 불구 하 고, 티미딘 수 (아마도) 문화에서 죽어가는 식물 조직에 의해 공급 될 수 있습니다. 따라서, 보조영양 아그로를 완전히 제어하기 위해 배지에 항생제를 제공할 필요성이 여전히 존재한다. 그러나, 티미딘의 부재에 있는 auxotrophic 긴장의 손상된 성장 때문에 통제하기 쉬울 것입니다. 감염 일자 4 일 전에, 50 mg / L 티미딘, 50 mg / L 젠타미신, 50 mg / L spectinomycin(표 1)로YP 플레이트에 박테리아를 줄무늬로 글리세롤 스톡에서 “어머니”접시를 시작합니다. “어머니” 플레이트를 20°C 인큐베이터에서 3일 동안 배양하였다. 감염 실험 하루 전에, “어머니”플레이트에서 1 ~ 5 개의 식민지를 선택하고 “어머니”플레이트에서 박테리아를 새로운 YP 판으로 줄무늬 (티미딘, 겐타마이신 및 스펙티노마이신과 함께)로 줄무늬를 사용하여 “작업”플레이트를 준비하십시오. 표 1). 순차적 사분면에서 매일 “작업”플레이트를 행진하고 연속적으로 희석 된 사분면을 형성하기 위해 반복, 연속 줄무늬 영역을 통해 루프 1을 실행합니다. 27°C 인큐베이터에서 하룻밤 동안 “작업” 플레이트를 배양한다. 배아 해부(4.8단계)를 완료한 후, 순환 또는 이와 유사한 도구를 사용하여 세균 성장이 식민지의 얇은 줄무늬로 보이는 “작업” 플레이트 영역에서 아그로박테리움을 수집합니다.참고 : 세균 성장의 조밀 한 잔디와 접시의 영역을 피하십시오. Agrobacterium 성장 가능성이 이미 조밀 한 지역에서 감소 하기 시작 했다, 눈에 보이는 식민지와 지역에서 박테리아는 감염에 대 한 적절 한 성장 단계에 있는 동안. 수집된 박테리아를 700A 액상 배지의 10 mL을 함유하는 50 mL 튜브에 중단한다(표1). 소용돌이는 박테리아 배양을 완전히 중단한다. 550 nm의 파장에서 광학 밀도를 측정합니다. OD가 0.35-0.45 사이가 될 때까지 볼륨을 조정하고 0.4는 최적의 값입니다.참고: OD가 0.45보다 높으면 700A 액체 배지를 더 추가합니다. OD가 0.35보다 낮으면, 현탁액 배양액에서 더 많은 아그로 콜로니를 접종한다. 4. 배아 해부, 감염 및 공동 재배 변환 실험에 적합한 귀를 선택하십시오. 이들은 좋은 종자 세트가 있어야하고 1.5-2.0 mm의 크기 범위배아가 있어야합니다. 그들은 일반적으로 수분 후 9-12 일 사이에 수확됩니다. 수확된 귀는 4°C에서 1-4일 동안 신선하게 사용하거나 보관할 수 있지만, 반응의 질은 첫날 이후 장기간 보관시 점진적으로 저하될 수 있습니다. 껍질과 실크를 제거합니다. 손잡이를 받침대 또는 귀 상단에 삽입합니다. 손잡이는 집게, 스크루 드라이버 등 한 쌍의 손잡이일 수 있습니다. 큰 용기에 귀를 놓습니다 (예 : 손잡이가 위쪽으로 2 L 비커를 넣고 용기를 소독 용액으로 채웁니다. 소독용액은 상업용 표백제 20%의 1.8L(1.65% 하이포아염소산나트륨)과 계면활성제 트웬 20방울의 몇 방울이다. 층류 벤치 내부의 귀를 살균합니다. 20 분 후, 표백제를 비우고 충분한 양의 멸균 증류수를 사용하여 귀를 3 x (각 5 분)로 헹구고. 물을 제거하고 귀가 몇 분 동안 건조되도록 하십시오.참고 : 귀가 20 분 동안 표백제 용액에 완전히 잠긴 것이 중요합니다. 700A 액체 배지로 채워진 2 mL 마이크로 원심 분리튜브를 준비합니다. 이 튜브는 미성숙한 배아를 수집하는 데 사용됩니다. 귀를 가지고 멸균 메스를 사용하여, 내유를 노출커널 크라운의 상단 1-2mm를 제거합니다. 미성숙한 zygotic 배아를 제거하기 위해 마이크로 주걱을 사용 (IZE). IZE는 커널, 귀 끝을 향한 측면, 그리고 코브에 부착된 근처에 있습니다. 주걱을 사용하여 배아에서 가장 먼 주피의 배유에 삽입 한 다음 부드럽게 위쪽으로 비틀어 배아를 제거하고 배아를 제거 할 수 있습니다(그림 2). 주걱을 사용하여, 700A 액체 배지를 포함하는 관으로 배아를 전달한다. 최대 100개의 배아가 수집될 때까지 계속 하십시오. 다음 단계로 진행하기 전에 여러 튜브가 충질될 수 있습니다(~100배아/튜브). 이 시점에서, 아그로박테리움 현탁액을 준비해야 한다(3.5단계 참조). 1 mL 파이펫으로 배아 관에서 700A 액체 배지를 제거합니다. 신선한 700A 배지를 추가하여 배아를 씻은 다음 해당 매체도 제거합니다. 아그로박테리움 서스펜션 1mL을 낮은 설정(3/10)에 넣고 30초 또는 12x-15x를 섞어 넣습니다. 이 튜브가 5분 동안 벤치에 수평으로 놓이도록 합니다. 5분 후, 배아 및 아그로박테리움 현탁액의 전체 튜브를 562V 공동 재배 배지의 플레이트상에 옮김(표1)으로옮니다. 이것은 벤치에 플레이트를 놓고 튜브 내용물판을 플레이트에 신속하게 부어 서 얻을 수 있습니다. 플레이트를 부드럽게 소용돌이쳐 배아를 분배하고 1 mL 파이펫을 사용하여 아그로박테리움 현탁액을 제거합니다. 배아가 위쪽을 향한 스큐럼(둥근) 면과 함께 놓여 있는지 확인합니다. 필요한 경우 돋보기 또는 해부 범위를 사용하십시오. 플라스틱 상자 (19cm x 28cm x 5.1 cm)에 접시를 놓고 어둠 속에서 21 °C에서 밤새 16-18 h의 판을 배양하십시오. 파라핀 필름이나 통풍구 테이프를 사용한 개별 플레이트 래핑은 필요하지 않습니다. 하룻밤 공동 재배 후, 감염된 배아를 위로 이동시키고, 스큐클룸 쪽을 위로, 휴식 배지 605T(표1)로이동한다. 접시 당 약 30 개의 배아를 놓습니다. 어둠 속에서 26-28 °C에서 플레이트를 배양합니다. 4-10 일 동안 배양하십시오 (7 일이 바람직하다). 이때, 체세포 배아의 발달은 접합성 스큐텔룸의 표면에서 관찰될 수있다(그림 3). 5. 선택, 열처리 및 재생 휴식 기간 후, 열은 배아를 충격. 배아판을 함유한 상자를 45°C 인큐베이터에 놓고 상대 습도를 70% 2시간 동안 합니다. 이어서, 45°C 인큐베이터로부터 상자를 제거하고 1-2시간 동안 26-28°C 다크 인큐베이터에 놓는다.참고: 인큐베이터에서 70%의 습도를 달성할 수 없는 경우, 접시 상자 바닥에 오토클레이브 종이 타월을 이중 층을 추가하고 박스 내의 습도를 유지하기 위해 오토클레이브 워터로 담가십시오. 접시를 종이 타월 위에 있는 상자에 넣고 뚜껑을 밀봉한 후 45°C에 놓습니다. 작은 디지털 습도계/온도계를 사용하여 온도와 습도를 모니터링합니다. 0.05 mg/L imazapyr를 포함하는 촬영 형성 배지(13329A)로 휴식 배지로부터 열처리된 IzEs를 선택적 제제로서 전달한다(표1). 옮길 때, 미세한 팁 집게 또는 외과 용 가위를 사용하여, 존재하는 경우, coleoptiles를 제거합니다. 과밀을 피하기 위해 접시 당 10-15 개의 배아를 놓습니다. 배아를 26°C 다크 인큐베이터에서 2주 동안 이 배지에 보관하였다. 배아를 뿌리 뽑기 배지로 옮기다 (13158; 표 1) 1-2 주 동안. 접시 당 약 8 개의 조각을 놓고 27 °C에서 가벼운 방이나 가벼운 챔버 (16 일 / 8 박, 20-150 μmol / m2/ s)에 배양하십시오. 식물이 발달함에 따라, 싹과 격렬한 뿌리를 모두 포함하는 더 강한 식물을 뿌리 기 질의 새로운 판에 놓고 접시 당 하나의 식물을 놓습니다. 이것은 강한 플랜렛 성장을 허용할 것입니다. 다른 7-14 일 동안 가벼운 방이나 가벼운 챔버에 접시를 놓습니다.참고 : 조심스럽게 매질과 잘 접촉할 수 있도록 플랜렛과 관련된 모든 굳은 면 조각을 제거하십시오. 식물이 더 활발해짐에 따라, 뿌리 박조 배지에서 식물을 제거하고 한천을 제거하기 위해 수돗물로 뿌리를 헹구어. 미리 젖은 토양없는 기판을 포함하는 냄비2 (~19cm2)에서3으로 개별 식물을 이식하십시오. 냄비를 배수구가 있는 트레이(27cm x 54cm)에 놓고 플라스틱 습도 돔으로 평평하게 덮습니다. 이러한 적응 단계는 상기 섹션 2(단계 2.1)에 기재된 성장 조건과 함께 성장 챔버 또는 온실에서 달성될 수 있다. 6. 온실에 이식 및 T1 씨앗의 생산 하루에 2 배 식물을 확인하십시오. 필요에 따라 물. 식물이 건조되지 않고 과수되지 않았는지 확인하십시오. 약간 건조한 기판을 유지하여 뿌리 성장을 촉진합니다.참고 : 습도 돔은 이식 후 4-7 일 제거 할 수 있습니다. 식물은 토양에 이식의 스트레스에서 눈에 띄게 회복 될 때까지이 작은 냄비에서 성장해야한다. 이 데 약 9-14 일이 소요됩니다. 전체 토양없는 플러그와 플랜렛을 1.5 갤런 (5.9 L) 냄비에 이식하십시오. 토양이 건조하다고 느낄 때 온실과 물을 유지하십시오. 15-9-12의 N-P-K가 있는 제어 방출 비료를 냄비에 추가하면 기판 혼합물에 통합되거나 표면에 도포할 수 있습니다. 식물에서 귀 싹이 나오기 시작하면 촬영 백을 사용하여 귀 싹을 덮습니다. 반투명 가방을 사용하여 새롭게 떠오르는 실크를 제거하지 않고 관찰할 수 있도록 하십시오. 촬영 가방은 제어 수분이 발생할 수 있습니다. 항상 백 트랜스 제닉 술을하는 것이 중요합니다. 실크가 나타난 후(1-2일), 등장한 실크를 균일한 길이로 다듬습니다. 이것은 껍질 잎의 상단 아래 약 2.5 cm가 될 것입니다. 70% 에탄올로 멸균된 깨끗한 가위를 사용하십시오. 실크를 다듬어 균일 한 술이 수분이 발생하기 위해 다음 날 개발합니다. 옥수수 유전자형의 대다수에 대 한, 수 분에 대 한 최적의 시간은 2-3 술 또는 실크 출현 후 일. 같은 식물 (자가 수분되는 경우) 또는 같은 근친의 야생 유형 (교차 또는 교차하는 경우)에서 꽃가루를 수집합니다. 술 봉지에 꽃가루를 모아 T0 식물의 실크 터프에 바하십시오. 꽃가루가 야생 형 (비 형) 식물에서 온 경우, 일반 갈색 술 가방에 꽃가루를 놓습니다. 꽃가루가 형질전환 식물에서 온 경우, 꽃가루를 녹색 줄무늬 백에 넣어 꽃가루가 형질전환임을 나타냅니다. 수분 세부 사항은 2.5-2.10 단계를 따릅니다. 수분 후 약 2 주 후에 귀에서 술 봉지를 제거하고 건조가 시작될 수 있습니다. 건조를 돕기 위해 수분 후 21-25 일 후에 식물에 물을 공급하지 말하십시오. 껍질을 뒤로 당겨 씨앗을 노출시킬 수도 있습니다. 이 방법은 또한 곰팡이를 방지하는 데 도움이됩니다. 수분 후 약 45일 간 씨앗을 수확하고 4-12°C의 냉장 보관에 보관하십시오.