Este flujo de trabajo describe el rendimiento del enriquecimiento eficiente en tiempo y costo de múltiples modificaciones post-traduccionales de proteínas (PTF) simultáneamente para el análisis proteómico global cuantitativo. El protocolo utiliza el enriquecimiento de PTM a nivel de péptido con múltiples anticuerpos conjugados, seguido de un análisis de espectrometría de masas de adquisición independiente de datos para obtener información biológica sobre la conversación cruzada PTM.
El estudio de múltiples modificaciones post-traduccionales (PTM) de proteínas es un paso crucial para entender la conversación cruzada de PTM y obtener información más holística sobre la función de las proteínas. A pesar de la importancia de los estudios de enriquecimiento multi-PTM, pocos estudios investigan más de una PTM a la vez, debido en parte a los gastos, el tiempo y las grandes cantidades de proteínas necesarias para realizar múltiples análisis proteómicos globales de los MPT. El enriquecimiento de afinidad “one-pot” detallado en este protocolo supera estas barreras al permitir la identificación y cuantificación simultánea de péptidos con residuos de lisina que contienen acetilación y succinilación PTMs con bajas cantidades de muestra Entrada. El protocolo implica la preparación de lisado proteico a partir de hígados de ratón de ratones knockout SIRT5, rendimiento de la digestión de trippsina, enriquecimiento para los PTM s y rendimiento del análisis espectrométrico de masas utilizando un flujo de trabajo de adquisición independiente de datos (DIA). Debido a que este flujo de trabajo permite el enriquecimiento de dos PTM de la misma muestra simultáneamente, proporciona una herramienta práctica para estudiar la conversación cruzada PTM sin necesidad de grandes cantidades de muestras, y reduce en gran medida el tiempo necesario para la preparación de la muestra, los datos de datos adquisición y análisis. El componente DIA del flujo de trabajo proporciona información completa específica de PTM. Esto es particularmente importante cuando se estudia la localización del sitio PTM, ya que DIA proporciona conjuntos completos de iones de fragmentos que se pueden descifrar computacionalmente para diferenciar entre diferentes isoformas de localización de PTM.
Una infinidad de modificaciones post-traduccionales regulan dinámicamente las proteínas y vías a través de efectos sobre la actividad1, señalización2, y la rotación3,4. Por ejemplo, las quinasas proteicas se activan o desactivan mediante la adición de los grupos de fosfato5,y la acetilación con histona y otras modificaciones proporcionan un mecanismo para cambiar la estructura de la cromatina y servir como mecanismos reguladores transcripcionales6,7. En los últimos años, se ha demostrado que múltiples PTMs trabajan en concierto o compiten para regular la función o actividad proteica8,9,10,11. Por lo tanto, entender la interferencia PTM es una necesidad emergente en la investigación de PTM. Sin embargo, la mayoría de los flujos de trabajo proteómicos disponibles para identificar y cuantificar los sitios PTM se centran en modificaciones únicas, en lugar de la interacción de múltiples modificaciones. El flujo de trabajo descrito correlaciona “puntos calientes” y residuos de lisina específicos que son modificados por varios MPT diferentes.
Existe una creciente necesidad en la comunidad científica de métodos factibles para estudiar múltiples PTM simultáneamente12. La mayoría de los métodos para identificar y cuantificar globalmente los sitios de múltiples tipos de PTMs son desafiantes debido a los altos costos y la cantidad de tejido requerido12,13. No solo los experimentos de enriquecimiento multi-PTM consumen mucho tiempo en términos de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis de datos, sino que estos estudios suelen requerir cantidades grandes y a menudo prohibitivas de proteína11. Aquí se describe un protocolo para el enriquecimiento y análisis simultáneos de múltiples PTM, que también aborda varias de estas barreras y permite la elaboración de perfiles PTM a gran escala y la evaluación de la conversación cruzada entre varios PM14. Este flujo de trabajo de una olla describe una manera práctica para que los investigadores biomédicos perfilen globalmente múltiples PTM, identifiquen péptidos modificados co-modificados y estudien la conversación cruzada PTM de una manera eficiente y rentable14,15.
Aquí, este método se muestra examinando la acilación de proteína mitocondrial, que se estudió por primera vez hace más de 50 años16. Se concentra específicamente en la acetilación de lisina17 y la succinilación18,incluyendo la co-ocurrencia de estas modificaciones en proteínas e incluso la co-modificación a nivel de péptido. Dado que el estudio utiliza un modelo de ratón noqueado sirtuin 5 (SIRT5), fue elegido para centrarse en el enriquecimiento de sitios de acetilación y succinilación. Esta decisión se tomó porque los sitios de socorro son objetivos de SIRT5 desuccinylase y, por lo tanto, se espera que muestren una regulación ascendente significativa en ratones KO, convirtiéndolos en los MCM más relevantes en este caso. Ambos MPT son biológicamente relevantes, como se resume recientemente en Carrico et al.19. En general, la acetilación muestra efectos importantes sobre la expresión génica y el metabolismo, y la socorro se ha divulgado para regular el metabolismo del corazón y la función20.
El protocolo descrito se puede realizar con una cantidad baja de material de entrada de proteínas (por ejemplo, 1 mg de lisato de proteína) y reduce la duración total del experimento al reducir el tiempo dedicado al procesamiento de muestras, la adquisición de EM y el análisis de datos. En la Figura 1se proporciona un esquema de flujo de trabajo. También hemos utilizado cantidades aún más bajas de material de partida (hasta 100 g de lisato proteico, reduciendo las cantidades de perlas utilizadas en consecuencia), lo que, como era de esperar, reduce el rendimiento global de los péptidos acillados identificados; sin embargo, todavía proporciona resultados muy valiosos y péptidos acilados cuantificables.
Mientras que los llamados flujos de trabajo de arriba hacia abajo o de media reducción normalmente no utilizan enfoques de digestión proteolítica (y, por lo tanto, mantienen la conectividad de varios PTM dentro de una proteína), este protocolo se centra en un enfoque de enriquecimiento de afinidad basado en péptidos para obtener profundidad y sensibilidad adicionales para la identificación y cuantificación de PTM(Figura 1). Además, este flujo de trabajo centrado en péptidos utiliza métodos modernos de espectrometría de masas, incluyendo 1) una combinación de adquisición dependiente de datos (DDA) para generar bibliotecas espectrales y 2) adquisición independiente de datos (DIA) para una cuantificación PTM precisa en un flujo de trabajo sin etiquetas.
Los flujos de trabajo DIA superan la estocasticidad de muestreo de los esquemas de exploración DDA típicos fragmentando exhaustivamente todas las señales de péptidos dentro del rango m/z muestreado21. Esta característica también es extremadamente beneficiosa en términos de localización del sitio, ya que es más fácil obtener información sobre qué iones de fragmentos específicos se modifican dentro del péptido. Además, los flujos de trabajo DIA permiten la identificación y cuantificación de isoformas menores de péptido PTM con iones precursores idénticos. Los métodos DIA también pueden determinar una localización específica del sitio PTM dentro de un péptido basado en iones de fragmentos correspondientes específicos que se miden exhaustivamente en todo momento. Sin embargo, los enfoques DDA a menudo utilizan características de “exclusión dinámica” que excluyen el muestreo múltiple de MS/MS para el mismo ion precursor, por lo que faltan isoformas menores de PTM.
La estrategia de enriquecimiento simultáneo que se describe aquí es ideal para estudios que se beneficiarán de la elaboración de perfiles y cuantificación global de múltiples PTM, examinando la conversación cruzada de PTM y entendiendo las interacciones dinámicas de las modificaciones post-traduccionales. La identificación de múltiples PTM enriquecidos en un flujo de trabajo combinado ha sido descrita por: enriquecimiento global, en serie o paralelo de PTM que contiene péptidos proteolíticos, o alternativamente por el análisis de proteínas intactas. En comparación directa con el enriquecimiento en serie de la acetilación y la succinilación, la eficiencia de la metodología de un solo pozo se estableció como muy similar14. Estos protocolos alternativos requieren cantidades significativas de material y tiempo de partida y pueden ser prohibitivamente caros. Por el contrario, el protocolo de un solo depósito proporciona un método económico y eficiente para el enriquecimiento de más de una PTM con análisis e identificación posteriores.
Los tejidos hepáticos de ratón se obtienen de ratones noqueadores SIRT5 y se utilizan aquí como material de partida. Este protocolo también se puede realizar para los leligadores proteicos de diferentes tejidos o experimentos de cultivo celular. Este protocolo se puede aplicar a los lelitos proteicos obtenidos de tejidos o pellets de cultivo celular.
Este protocolo describe una técnica novedosa para el enriquecimiento simultáneo de Múltiples PTM para comprender más eficazmente la interferencia PTM. Los métodos alternativos para alcanzar este objetivo tienden a ser prohibitivamente lentos y costosos, y requieren grandes cantidades de proteína para tener éxito11,13. Este protocolo presenta un flujo de trabajo de enriquecimiento multi-PTM que implica la incubación en cuentas conjugadas por anticuerpos para dos PTM a la vez para mejorar la eficiencia general del experimento. Este método también implica el uso de DDA para la generación de bibliotecas espectrales y adquisiciones de DIA MS para detectar y cuantificar los péptidos presentes con interferencia reducida de los iones de fragmentos22,23. Los programas de software, como los motores de búsqueda de bases de datos MS, se utilizan para analizar y cuantificar datos de adquisiciones de DDA, mientras que Quantitative Proteomics Software24 y el software de análisis cuantitativo diaespecífico 25 son necesarios para interpretar los espectros complejos producidos por las adquisiciones de DIA.
Hay varios pasos críticos dentro de este protocolo que deben seguirse cuidadosamente. Como el objetivo principal del protocolo es enriquecer para múltiples PTMs simultáneamente, el paso de enriquecimiento de anticuerpos-afinidad (sección 2) es crítico para el éxito del experimento. Al realizar lavados en las cuentas, es necesario asegurarse de que ninguna de las cuentas se aspira accidentalmente. También es necesario asegurarse de que la concentración de urea se ha diluido a 1 M antes de la digestión con tripsina (paso 1.8). Aunque se requiere urea de 8 M anteriormente en el protocolo de solubilización de proteínas, las concentraciones de urea por encima de 1 M inhibirán la actividad enzimática de la trippsina. Además, es importante comprobar constantemente el pH de la muestra en todo el protocolo. Esto es especialmente importante antes de la digestión. Si el pH de la muestra y la solución de trippsina no se neutralizan adecuadamente antes de la incubación, puede resultar en una digestión ineficiente en la que muchos sitios de escisión pueden perderse, lo que resulta en menos identificaciones de péptidos.
Algunas modificaciones en el protocolo pueden ser útiles al preparar muestras. Para un lisato proteico adquirido a partir de 1 mg de material de partida, una cuarta parte de las perlas de anticuerpos proporcionadas en cada tubo de exploración PTM se pueden utilizar como una alternativa rentable. Se puede utilizar una mayor cantidad de material de partida para obtener mejores resultados, siempre y cuando la cantidad de perlas de anticuerpos utilizadas se incremente proporcionalmente. Otra modificación que puede mejorar el flujo de trabajo es digerir muestras con otra proteasa además de la trippsina. Esta modificación resultaría en una mayor variabilidad en los péptidos aislados, proporcionando una mayor cobertura de los residuos de proteínas. Aunque no es necesario, se recomienda que la trippsina sea una de las enzimas utilizadas para el análisis de PTM debido a su alta especificidad de escisión26.
Una limitación de este protocolo es que los PTM que se están estudiando necesitan tener químicos similares para ser enriquecidos simultáneamente14. Los procedimientos para las diferentes perlas conjugadas con anticuerpos deben ser similares, utilizando disolventes y soluciones similares, incluidas condiciones de elución similares, y preferiblemente del mismo proveedor. Por esta razón, el método descrito aquí utiliza consistentemente la acetilación y la succinilación como ejemplo, que utilizan perlas conjugadas con anticuerpos (Cell Signaling Technology, Inc). Aunque este método se puede aplicar teóricamente a cualquier número de PTM, se necesitarían estudios adicionales para evaluar la limitación exacta del protocolo a este respecto. Además, dado que se trata de un método de enriquecimiento basado en anticuerpos, el método sólo puede proporcionar una cuantificación relativa de los sitios PTM.
En comparación con los métodos de enriquecimiento multi-PTM existentes, este flujo de trabajo es una alternativa más factible y rentable. A partir de este experimento, se observó que la eficacia de este método se compara muy bien con métodos alternativos, como los enriquecimientos individuales o en serie. La Figura 2B muestra que la mediana del CV para las áreas de pico de péptidos modificados se redujo realmente en el método de un solo bote en comparación con los enriquecimientos de un solo PTM y los enriquecimientos de serie-PTM13. Analizamos además los resultados experimentales que evalúan las cuantificaciones a nivel de sitio para la acetilación o la succinilación. Además, el análisis de correlación de Spearman(Figura 2C,D)demostró que el enriquecimiento de PTM de un solo depósito se realizaba de forma similar a los flujos de trabajo de enriquecimiento de PTM único. Esto también fue cierto para las correlaciones a nivel de péptidos y fragmentos. La misma observación se mantuvo para las tres correlaciones al comparar una olla con el enriquecimiento de PTM en serie.
Este protocolo permite a los investigadores obtener información biológica fascinante sobre la conversación cruzada PTM de una manera rápida y rentable. El componente DIA del flujo de trabajo permite a los investigadores comprender más acerca de los PTM, ya que proporciona información sobre la localización del sitio y supera desafíos como la baja ocupación del sitio de los PMM. Los iones precursores tienden a excluirse con DDA, lo que es particularmente importante al estudiar los PTF, ya que la ocupación del sitio es a menudo baja hasta el punto en que estos péptidos no se seleccionan para MS/MS pero todavía contienen información crucial. Se podrían realizar experimentos de seguimiento para evaluar el límite superior de cuántos MPT se pueden enriquecer simultáneamente utilizando este método. Una mejora futura de este flujo de trabajo puede incluir el desarrollo de plataformas de software más avanzadas para automatizar aún más el análisis de la localización del sitio y la ocupación del sitio PTM.
The authors have nothing to disclose.
Reconocemos el apoyo de la subvención de instrumentación compartida NIH para el sistema TripleTOF en el Buck Institute (1S10 OD016281). Este trabajo también fue apoyado por el Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas (R01 AI108255 a B.S.) y el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (R24 DK085610 a Eric Verdin; R01 DK090242 a Eric Goetzman). X.X. fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Salud (NIH grant T32GM8806, a Judith Campisi y Lisa Ellerby), N.B. fue apoyada por una beca postdoctoral de la Glenn Foundation for Medical Research.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |