يصف سير العمل هذا أداء الإثراء الفعال للوقت والتكلفة للتعديلات المتعددة للبروتين بعد الترجمة (PTMs) في وقت واحد للتحليل الكمي العالمي للبروتيوميات. يستخدم البروتوكول تخصيب PTM على مستوى الببتيد مع أجسام مضادة مترافقة متعددة ، يليه تحليل قياس الطيف الكتلي للاستحواذ المستقل عن البيانات للحصول على رؤى بيولوجية في الكلام المتبادل PTM.
دراسة تعديلات متعددة بعد الترجمة (PTMs) من البروتينات هو خطوة حاسمة لفهم PTM الحديث المتبادل والحصول على رؤى أكثر شمولية في وظيفة البروتين. على الرغم من أهمية دراسات الإثراء متعددة PTM، إلا أن القليل من الدراسات تحقق في أكثر من عملية PTM واحدة في وقت واحد، ويرجع ذلك جزئيًا إلى النفقات والوقت وكميات البروتين الكبيرة المطلوبة لإجراء تحليل بروتيوميكي عالمي متعدد لـ PTMs. و “وعاء واحد” التخصيب تقارب مفصلة في هذا البروتوكول يتغلب على هذه الحواجز من خلال السماح في وقت واحد تحديد والقياس الكمي من الببتيدات مع بقايا الليسين التي تحتوي على أسيتيل وPTMs succinylation مع كميات منخفضة من العينة الادخال. البروتوكول ينطوي على إعداد البروتين lysate من أكباد الماوس من الفئران SIRT5 خروج المغلوب، وأداء الهضم التربسين، وإثراء لPTMs، وأداء تحليل الطيف الكتلي باستخدام عملية اقتناء مستقلة عن البيانات (DIA) سير العمل. لأن هذا سير العمل يسمح لإثراء اثنين من PTMs من نفس العينة في وقت واحد، فإنه يوفر أداة عملية لدراسة PTM الحديث المتبادل دون الحاجة إلى كميات كبيرة من العينات، ويقلل كثيرا من الوقت اللازم لإعداد العينة، والبيانات الاستحواذ والتحليل. يوفر مكون DIA لسير العمل معلومات شاملة خاصة بـ PTM. هذا مهم بشكل خاص عند دراسة تعريب موقع PTM ، حيث توفر DIA مجموعات شاملة من الأيونات المجزأة التي يمكن فك تشفيرها حسابيًا للتمييز بين أشكال تعريب PTM المختلفة.
عدد لا يحصى من التعديلات ما بعد الترجمة تنظيم البروتينات ومسارات حيوي من خلال آثار على النشاط1، مما يشيرإلى 2، ودوران3،4. على سبيل المثال ، يتم تنشيط kinases البروتين أو تعطيلها عن طريق إضافة مجموعات الفوسفات5، وخل الهستون وغيرها من التعديلات توفر آلية لتغيير بنية الكروماتين وبمثابةآلياتتنظيمية النسخ6،7. في السنوات الأخيرة ، وقد شنت الأدلة على أن PTMs متعددة تعمل في تناغم أو تتنافس لتنظيم وظيفة البروتين أو النشاط8،9،10،11. ولذلك ، فهم PTM الحديث المتبادل هو حاجة ناشئة في البحوث PTM. ومع ذلك ، فإن معظم سير العمل البروتوميكية المتاحة لتحديد وتحديد مواقع PTM تركز على تعديلات مفردة ، بدلاً من التفاعل مع تعديلات متعددة. يرتبط سير العمل الموصوف بتعديل بروتين محدد “النقاط الساخنة” وبقايا الليسين التي يتم تعديلها بواسطة العديد من PTMs المختلفة.
وهناك حاجة متزايدة في الأوساط العلمية إلى أساليب مجدية لدراسة آليات منع البتات المتعددة في وقت واحد12. معظم الأساليب لتحديد وتحديد المواقع على الصعيد العالمي من أنواع متعددة من PTMs هي صعبة بسبب ارتفاع التكاليف وكمية الأنسجة المطلوبة12،13. لا تقتصر تجارب الإثراء متعدد PTM على استهلاك الوقت من حيث إعداد العينات والحصول على البيانات وتحليل البيانات ، ولكن هذه الدراسات تتطلب عادة كميات كبيرة وباهظة في كثير من الأحيان من البروتين11. وصف هنا هو بروتوكول للتخصيب في وقت واحد وتحليل PTMs متعددة، والذي يعالج أيضا العديد من هذه الحواجز وتمكن على نطاق واسع PTM التنميط وتقييم الكلام المتبادل بين مختلف PTMs14. هذا سير العمل وعاء واحد يحدد طريقة عملية للباحثين في الطب الحيوي لملفات PTMs متعددة على الصعيد العالمي ، وتحديد الببتيدات المعدلة ، ودراسة PTM crosstalk بطريقة فعالة وفعالة من حيث التكلفة14،15.
هنا ، يتم عرض هذه الطريقة من خلال فحص الميتوكوندريا بروتين acylation ، الذي درس لأول مرة منذ أكثر من 50 عاما16. وهو يركز على وجه التحديد على أسيتيل الليسين17 والسكسينيل18، بما في ذلك المشاركة في حدوث هذه التعديلات على البروتينات وحتى التعديل المشترك على مستوى الببتيد. وبما أن الدراسة تستخدم نموذج فأرة خروج المغلوب سيرتوين 5 (SIRT5)، فقد تم اختيارها للتركيز على إثراء مواقع الأسيتيل والسكشن. وقد اتخذ هذا القرار لأن مواقع السكسينيل هي أهداف لـ SIRT5 desuccinylase ومن المتوقع بالتالي أن تظهر زيادة كبيرة في فئران KO ، مما يجعلها أكثر PTMs ذات صلة في هذه الحالة. وكلا الأمرين وثيقا الصلة بيولوجياً على النحو الذي لخصه مؤخراً شركة كاريكو وآخرون19. بشكل عام ، يظهر الأسيتيل تأثيرات مهمة على التعبير الجيني والتمثيل الغذائي ، وقد تم الإبلاغ عن السكسينيل لتنظيم استقلاب القلب والوظيفة20.
يمكن تنفيذ البروتوكول الموصوف بكمية منخفضة من مواد مدخلات البروتين (على سبيل المثال، 1 ملغ من البروتين) ويقلل من المدة الإجمالية للتجربة عن طريق تقليل الوقت المستغرق في معالجة العينات، واكتساب التصلب المتعدد، وتحليل البيانات. يتم توفير مخطط سير العمل في الشكل 1. كما استخدمنا كميات أقل من المواد الأولية (وصولاً إلى 100 ميكروغرام من البروتين، مما يقلل من كميات الخرز المستخدمة وفقاً لذلك)، وهو ما يقلل، كما هو متوقع، من الغلة الإجمالية للببتيدات المنجلة المحددة؛ ومع ذلك، فإنه لا يزال يوفر نتائج قيمة للغاية والببتيدات القابلة للقياس الكمي.
في حين أن ما يسمى سير العمل من أعلى إلى أسفل أو من منتصف إلى أسفل عادة لا تستخدم نهج الهضم البروتيني (وبالتالي الحفاظ على اتصال PTMs متعددة داخل بروتين واحد)، وهذا البروتوكول يركز على نهج التخصيب تقارب الببتيد القائم على اكتساب عمق إضافي وحساسية لتحديد PTM والقياس الكمي(الشكل 1). بالإضافة إلى ذلك ، يستخدم سير العمل هذا الببتيد المتمحور حول أساليب قياس الطيف الكتلي الحديثة ، بما في ذلك 1) مزيج من الاستحواذ المعتمد على البيانات (DDA) لإنشاء مكتبات طيفية ، و 2) اكتساب مستقل عن البيانات (DIA) للقياس الكمي الدقيق لـ PTM في سير عمل خالٍ من التسمية.
تعمل مهام سير عمل DIA على التغلب على أخذ العينات من مخططات المسح الضوئي النموذجية DDA عن طريق تجزئة جميع إشارات الببتيد بشكل شامل داخل نطاق m/z العينات21. هذه الميزة مفيدة للغاية أيضًا من حيث تعريب الموقع ، لأنه من الأسهل الحصول على معلومات حول أي أي من الأجزاء المحددة يتم تعديلها داخل الببتيد. وبالإضافة إلى ذلك، تسمح سير عمل DIA بتحديد وقياس كمية أشكال ISOforms PTM-peptide البسيطة مع الأيونات السلائف متطابقة. يمكن لأساليب DIA أيضًا تحديد توطين موقع PTM محدد داخل الببتيد استنادًا إلى أيونات جزء محددة مناظرة يتم قياسها بشكل شامل في جميع الأوقات. ومع ذلك، غالباً ما تستخدم نهج DDA ميزات “الاستبعاد الديناميكي” التي تستبعد أخذ عينات متعددة من MS/MS لنفس الأيون السلائف، وبالتالي فهي تفتقد أشكال الـ PTM الثانوية.
إن استراتيجية الإثراء المتزامن الموصوفة هنا مناسبة بشكل مثالي للدراسات التي ستستفيد من التنميط العالمي والقياس الكمي لـ PTMs متعددة ، وفحص المحادثات المتقاطعة PTM ، وفهم التفاعلات الديناميكية للتعديلات ما بعد الانتقالية. وقد تم وصف تحديد PTMs المخصب متعددة في سير عمل واحد مجتمعة من قبل: الإثراء العالمي أو المسلسل أو الموازي PTM التي تحتوي على الببتيدات البروتينية، أو بدلا من ذلك عن طريق تحليل البروتينات سليمة. في مقارنة مباشرة مع الإثراء التسلسلي للأسيتيل والسكسينيل ، تم تحديد كفاءة منهجية وعاء واحد على أنها مشابهة للغاية14. وتتطلب هذه البروتوكولات البديلة كميات كبيرة من المواد والوقت الأوليين ويمكن أن تكون باهظة التكلفة. وعلى النقيض من ذلك، يوفر بروتوكول الوعاء الواحد طريقة غير مكلفة وفعالة لإثراء أكثر من آلية واحدة للإدارة المؤقتة مع التحليل والتحديد اللاحقين.
يتم الحصول على أنسجة كبد الماوس من الفئران SIRT5 خروج المغلوب وتستخدم هنا كمادة البداية. ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ هذا البروتوكول لlysates البروتين من مختلف الأنسجة أو تجارب زراعة الخلايا. ويمكن تطبيق هذا البروتوكول على البروتين اتلاف التي تم الحصول عليها من الأنسجة أو خلايا الكريات الخلايا.
يصف هذا البروتوكول تقنية جديدة لإثراء PTM متعددة في وقت واحد لفهم ptm عبر talk. الطرق البديلة للوصول إلى هذا الهدف تميل إلى أن تكون باهظة تستغرق وقتا طويلا ومكلفة، وأنها تتطلب كميات كبيرة من البروتين لتكون ناجحة11،13. يقدم هذا البروتوكول سير عمل تخصيب متعدد PTM يتضمن احتضان الخرز المترافق مع الأجسام المضادة لاثنتين من أجهزة منع الPTM في وقت واحد لتحسين الكفاءة الإجمالية للتجربة. تتضمن هذه الطريقة أيضًا استخدام DDA لتوليد المكتبة الطيفية ومقتنيات DIA MS للكشف عن الببتيدات الموجودة مع التداخل المخفض من الأيونات المجزأة22و23. وتستخدم برامج حاسوبية، مثل محركات البحث في قاعدة بيانات الماجستير لتحليل البيانات من عمليات الشراء DDA وقياسها، في حين أن برنامج البروتيوميات الكمي24 وبرنامج التحليل الكمي المحددة DIA25 ضروريان لتفسير الأطياف المعقدة التي تنتجها عمليات الاستحواذ على DIA.
هناك العديد من الخطوات الهامة في هذا البروتوكول التي ينبغي اتباعها بعناية. وبما أن الهدف الرئيسي للبروتوكول هو الإثراء لـ PTMs متعددة في وقت واحد ، فإن خطوة تخصيب الأجسام المضادة (القسم 2) أمر بالغ الأهمية لنجاح التجربة. عند أداء غسل على الخرز، فمن الضروري لضمان أي من الخرز يتم استنشاقها بطريق الخطأ. ضمان تركيز اليوريا قد تم تخفيفها إلى 1 M قبل الهضم مع التربسين (الخطوة 1.8) هو ضروري أيضا. على الرغم من أن مطلوب 8 M اليوريا في وقت سابق في البروتوكول لذوبان البروتين, تركيزات اليوريا فوق 1 M سوف تمنع النشاط الأنزيمي التربسين. بالإضافة إلى ذلك ، من المهم التحقق باستمرار من درجة الحموضة للعينة في جميع أنحاء البروتوكول. هذا مهم بشكل خاص قبل الهضم. إذا لم يتم تحييد درجة الحموضة للعينة ومحلول التربسين بشكل مناسب قبل الحضانة ، فقد يؤدي ذلك إلى عملية هضم غير فعالة حيث قد يتم تفويت العديد من مواقع الانقسام ، مما يؤدي إلى تحديد عدد أقل من الببتيد.
قد تكون بعض التعديلات على البروتوكول مفيدة عند إعداد العينات. للحصول على بروتين ليسات تم شراؤها من 1 ملغ من المواد الأولية ، يمكن استخدام ربع حبات الأجسام المضادة المتوفرة في كل أنبوب فحص PTM كبديل فعال من حيث التكلفة. يمكن استخدام كمية أكبر من مواد البدء للحصول على نتائج أفضل ، طالما يتم زيادة كمية حبات الأجسام المضادة المستخدمة بشكل متناسب. تعديل آخر يمكن أن تعزز سير العمل هو هضم عينات مع بروتياز آخر بالإضافة إلى التربسين. ومن شأن هذا التعديل أن يؤدي إلى مزيد من التباين في الببتيدات المتشبثة، مما يوفر تغطية متزايدة لمخلفات البروتين. على الرغم من أنه ليس من الضروري ، فمن المستحسن أن يكون التربسين أحد الإنزيمات المستخدمة لتحليل PTM بسبب خصوصيته العالية في الانقسام26.
ومن القيود المفروضة على هذا البروتوكول أن الآليات التي تجري دراستها تحتاج إلى كيمياء مماثلة لكي يتم إثراؤها في وقت واحد14. يجب أن تكون إجراءات الخرز المختلف للأجسام المضادة المترافقة متشابهة ، باستخدام مذيبات وحلول مماثلة ، بما في ذلك ظروف elution مماثلة ، ويفضل أن يكون من نفس البائع. لهذا السبب، تستخدم الطريقة الموضحة هنا باستمرار الأسيتيل والسكسينيل كمثال، وكلاهما يستخدم الخرز المتجانس بالأجسام المضادة (تكنولوجيا الإشارات الخلوية، وشركة). وعلى الرغم من أن هذه الطريقة يمكن تطبيقها نظرياً على أي عدد من آليات منع التجارة، فإن الأمر يحتاج إلى دراسات إضافية لتقييم القيد الدقيق للبروتوكول في هذا الصدد. وعلاوة على ذلك، وبما أن هذه طريقة تخصيب الأجسام المضادة، فإن هذه الطريقة لا يمكن أن توفر سوى تقدير كمي نسبي لمواقع الـ PTM.
وبالمقارنة مع أساليب الإثراء القائمة المتعددة الآليات، فإن سير العمل هذا هو بديل أكثر جدوى وفعالية من حيث التكلفة. من هذه التجربة، لوحظ أن فعالية هذه الطريقة تقارن بشكل جيد للغاية مع الأساليب البديلة، مثل الإثراء الفردي أو التسلسلي. ويبين الشكل 2باء أن السيرة الذاتية المتوسطة لمناطق ذروة الببتيد المعدلة قد انخفضت بالفعل في طريقة الوعاء الواحد بالمقارنة مع عمليات الإثراء أحادية الـ PTM والإثراءات المتسلسلة – PTM13. كما قمنا بتحليل النتائج التجريبية التي تقيّم التميّز الكمي على مستوى الموقع للتكيس أو السكّين. بالإضافة إلى ذلك، أظهر تحليل ارتباط سبيرمان(الشكل 2C,D)أن تخصيب PTM أحادي الوعاء كان يؤدي نفس الأداء لسير عمل الإثراء أحادي ة الـ PTM. وينطبق هذا أيضا على الارتباطات على مستوى الببتيد وشظية المستوى. ونفس الملاحظة التي أبديت بالنسبة لجميع الارتباطات الثلاثة عند مقارنة وعاء واحد مع الإثراء التسلسلي لـ PTM.
يسمح هذا البروتوكول للباحثين بإنشاء رؤى بيولوجية رائعة في الحديث المتبادل PTM بطريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة. يسمح عنصر DIA في سير العمل للباحثين بفهم المزيد عن PTMs ، لأنه يوفر معلومات حول توطين الموقع ويتغلب على التحديات مثل انخفاض إشغال موقع PTMs. تميل الإصدارات السلائف إلى الاستبعاد مع DDA ، وهو أمر مهم بشكل خاص عند دراسة PTMs ، حيث أن إشغال الموقع غالبًا ما يكون منخفضًا لدرجة أن هذه الببتيدات لا يتم اختيارها لـ MS / MS ولكنها لا تزال تحتوي على معلومات حاسمة. ويمكن إجراء تجارب متابعة لتقييم الحد الأعلى لعدد الآليات التي يمكن إثراؤها في وقت واحد باستخدام هذه الطريقة. وقد يشمل التحسين المستقبلي لسير العمل هذا تطوير منصات برمجية أكثر تقدماً لزيادة أتمتة تحليل تعريب الموقع وإشغال موقع PTM.
The authors have nothing to disclose.
نحن نعترف بالدعم المقدم من منحة الأجهزة المشتركة في المعاهد القومية للصحة لنظام TripleTOF في معهد باك (1S10 OD016281). كما تم دعم هذا العمل من قبل المعهد الوطني للحساسية والأمراض المعدية (R01 AI108255 إلى B.S.) والمعهد الوطني للسكري وأمراض الجهاز الهضمي والكلى (R24 DK085610 إلى إريك فردين. R01 DK090242 إلى اريك جوتزمان). تم دعم X.X. بمنحة من المعاهد الوطنية للصحة (منحة المعاهد القومية للصحة T32GM8806 ، إلى جوديث كامبيسي وليزا إليربي) ، تم دعم N.B. من خلال زمالة ما بعد الدكتوراه من مؤسسة جلين للأبحاث الطبية.
1 M Triethylammonium biocarbonate buffer (TEAB) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T7408 | |
Acetonitrile, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 36XL66 | |
Bioruptor sonicator | Diagenode, Denville, NJ, USA | B01020001 | |
C18 pre-column chip (200 µm x 6 mm ChromXP C18-CL chip, 3 um, 120 A) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 5015841 | |
C18-CL chip (75 µm x 15 cm ChromXP, 3 µm, 300 Å) | SCIEX, Framingham, MA, USA | 804-00001 | |
Dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | D9779-5G | |
Eppendorf Thermomixer Compact | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | T1317-1EA | |
Eppendorf Tube (2.0 mL Safelock) | Eppendorf AG, Hamburg, Germany | 22363352 | |
Formic acid | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | F0507-500ML | |
Indexed retention time (iRT) normalization peptide standard | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Ki-3002-2 | |
Iodoacetamide (IAA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | I1149-25G | |
mapDIA | web link | software for interference removal of DIA datasets | |
Methanol, Burdick and Jackson LC-MS grade | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | BJLC230-4 | |
PURELAB flex 1 ultrapure water dispenser | VWR International, Radnor, PA, USA | 89204-088 | |
mProphet in Skyline | incorporated in Skyline | integrated statistical algorithms for FDR assessments | |
Oasis HLB SPE cartridges | Waters Corp., Milford, MA, USA | WAT094225 | cartridges for desalting protein lysates, up to 50 mg material |
Phosphate buffered saline solution | Life Technologies | 10010023 | |
Pierce BCA Assay | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 23225 | |
ProteinPilot 5.0 – 'MS database search engine' | SCIEX, Framingham, MA, USA | software download SCIEX | MS database search engine |
PTMScan Succinyl-Lysine Motif [Succ-K] Kit #13764 | Cell Signaling Technology | 13764 | antibody beads for affinity enrichment |
PTMScan Acetyl-Lysine Motif [Ac-K] Kit #13416 | Cell Signaling Technology | 13416 | antibody beads for affinity enrichment |
Sequencing-grade lyophilized trypsin | Life Technologies | 23225 | |
Skyline – 'Quantitative Proteomics Software' | MacCoss lab (academic) | open source software | Quantitative Proteomics Software (academic) |
Spectronaut – 'DIA Quantitative Analysis Software' | Biognosys AG, Schlieren, Zurich, Switzerland | Sw-3001 | DIA Quantitative Analysis Software / PTM site localization |
Thermo Scientific Savant SPD131DDA Speedvac Concentrator | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | SPD131DDA-115 | instrument to concentrate liquid volume of samples |
TissueLyser II | Qiagen, Hilden, Germany | 85300 | instrument for efficient lysis of tissue |
Trifluoroacetic acid (TFA) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA | T6508-1L | |
TripleTOF 6600: orthoganol quadrupole time-of-flight (QqTOF)mass spectrometer | SCIEX, Framingham, MA, USA | Per quote | high resolution mass spectrometer |
Ultra Plus nano-LC 2D HPLC system | SCIEX, Eksigent Division, Framingham, MA, USA | Model #845 | chromatographic separation system |
Urea | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | PI29700 | |
Water, Burdick and Jackson LC-MS | Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA | 600-30-76 | |
ZipTip C18 Pipette Tips, P10 | Merck Millipore Ltd, Tullagreen, Carrigtwohill, Co. Cork, IRL | ZTC18S096 | C-18 resin loaded tips for desalting of peptide mixtures |