Synaptiska anslutningar är kritiska till neural kretsfunktion, men den exakta topologi och fysiologi synapser inom neurala kretsar är ofta svåra att sondera experimentellt. Detta beror på att elektrisk stimulering, det traditionella verktyget för cellulär elektrofysiologi, urskillningslöst aktiverar axoner nära stimuleringsplatsen, och i de flesta hjärnregioner, axoner från olika källor (lokala, stigande och/eller fallande) intertwine. Men genom att använda channelrhodopsin assisterad krets kartläggning (CRACM)^1,2, denna begränsning kan nu övervinnas³. Channelrhodopsin (ChR2) är en ljusaktiverad, katjon-selektiv jonkanal som ursprungligen hittades i den gröna alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveras med blått ljus av en våglängd runt 450-490 nm, depolarisera cellen genom katjontillströmningen. ChR2 beskrevs först och uttrycktes i Xenopus äggceller av Nagel och kollegor⁴. Kort därefter uttryckte Boyden och kollegor⁵ ChR2 i däggdjursnervceller och visade att de kunde använda ljuspulser för att på ett tillförlitligt sätt kontrollera spikning på en millisekundstidsskala, vilket inducerar åtgärdspotentialerna ~ 10 ms efter aktivering av ChR2 med blått ljus. Optogenetiska kanaler med ännu snabbare kinetik har hittats nyligen (t.ex. Chronos⁶).

Den grundläggande metoden för en CRACM experiment är att transfect en population av förmodade presynaptiska nervceller med en rekombinant adeno-associerade virus (rAAV) som bär den genetiska informationen för en channelrhodopsin. Transfection av nervceller med rAAV leder till uttrycket av den kodade channelrhodopsin. Typiskt är channelrhodopsin märkt med ett fluorescerande protein som GFP (Green Fluorescerande protein) eller tdTomato (ett rött fluorescerande protein), så att transfection av nervceller i målregionen lätt kan bekräftas med fluorescens avbildning. Eftersom rAAVs är icke-patogena, har en låg inflammatorisk potential och långvariga genuttryck^7,8, de har blivit en standard teknik för att leverera channelrhodopsins till nervceller. Om, efter transfection av en förmodade presynaptic befolkningen av nervceller, aktivering av en channelrhodopsin genom ljusblinkar framkallar postsynaptiska potentialer eller strömmar i målet nervceller, Detta är ett bevis på en axonal anslutning från den transfected kärnan till den inspelade cellen. Eftersom avhuggna axoner i hjärnan skiva experiment kan drivas att släppa signalsubstansen genom channelrhodopsin aktivering, nuclei som ligger utanför den akuta skiva men skicka axoner i postsynaptic hjärnan regionen kan identifieras med CRACM. Kraften i denna teknik är att anslutningen och fysiologiidentifierade långväga synaptiska ingångar kan undersökas direkt.

Förutom channelrhodopsins som är retliga av blått ljus, utredare har nyligen identifierat flera rödskiftade channelrhodopsins^9,10, inklusive Chrimson och dess snabbare analoga ChrimsonR, som båda är glada med rött ljus på ~ 660 nm⁶. Rödskiftade opsins är av intresse eftersom rött ljus tränger in vävnad bättre än blått ljus, och rött ljus kan ha en lägre cytotoxicitet än blått ljus^10,11,12. Rödskiftade channelrhodopsins öppnar också upp möjligheten till dubbla färg CRACM experiment, där konvergensen av axoner från olika kärnor på samma neuron kan testas i ett experiment^6,13,14. Men nuvarande rödskiftade opsins uppvisar ofta oönskadkorsaktivering med blått ljus^15,16,17, vilket gör två färgexperiment svåra. Dessutom har vissa rapporter visat att ChrimsonR genomgår begränsad axonal handel, vilket kan göra det svårt att använda ChrimsonR för CRACM experiment^16,17.

Nästan alla stigande prognoser från den lägre auditiva hjärnstammen kärnor konvergerar i sämre colliculus (IC), midbrain navet i den centrala auditiva vägen. Detta inkluderar projektioner från cochlear kärnan (CN)^18,19, de flesta av de överlägsna olivary komplex (SOC)²⁰, och dorsala (DNLL) och ventral (VNLL) kärnor av laterala lemniscus²¹. Dessutom avslutas en stor fallande projektion från hörselbarken i IC^{18,19,20,21,22}, och IC nervceller själva synapse i stort sett inom den lokala och kontralaterala lober ic ic²³. Den sammanblandning av axoner från många källor har gjort det svårt att sondera IC kretsar med elektrisk stimulering²⁴. Som ett resultat, även om nervceller i IC utföra utrop viktigt för ljudlokalisering och identifiering av tal och annan kommunikation ljud^25,26, organisationen av neurala kretsar i IC är i stort sett okänd. Vi identifierade nyligen VIP-nervceller som den första molekylärt identifierbara neuron klassen i IC²⁷. VIP nervceller är glutamaterga stellate nervceller som projektet till flera långväga mål, inklusive auditiva talamus och överlägsen colliculus. Vi kan nu bestämma källorna och funktionen hos lokala och långväga ingångar till VIP-nervceller och för att avgöra hur dessa kretsanslutningar bidrar till ljudbehandling.

Protokollet som presenteras här är skräddarsytt för att undersöka synaptiska ingångar till VIP-nervceller i IC av möss, särskilt från den kontralaterala IC och DCN(figur 1). Protokollet kan enkelt anpassas till olika källor till input, en annan neuron typ eller en annan hjärnregion helt och hållet. Vi visar också att ChrimsonR är en effektiv rödskiftad channelrhodopsin för långväga krets kartläggning i hörselhjärnstammen. Vi visar dock att ChrimsonR är starkt aktiverad av blått ljus, även vid låga intensiteter, och därmed för att kombinera ChrimsonR med Chronos i tvåfärgade CRACM-experiment, måste noggranna kontroller användas för att förhindra korsaktivering av ChrimsonR.