Synaptiske forbindelser er avgjørende for neural kretsfunksjon, men den nøyaktige topologien og fysiologien til synapser innenfor nevrale kretser er ofte vanskelige å sondere eksperimentelt. Dette skyldes at elektrisk stimulering, det tradisjonelle verktøyet for cellulær elektrofysiologi, ukritisk aktiverer aksoner i nærheten av stimuleringsstedet, og i de fleste hjerneregioner henger aksoner fra forskjellige kilder (lokalt, stigende og/eller synkende). Men ved hjelp av channelrhodopsin assistert kretskartlegging (CRACM)^1,2, kan denne begrensningen nå^{overvinnes 3}. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktivert, kation-selektiv ion kanal opprinnelig funnet i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres av blått lys av en bølgelengde rundt 450-490 nm, depolarisere cellen gjennom kation tilstrømning. ChR2 ble først beskrevet og uttrykt i Xenopus oocytes av Nagel og kolleger⁴. Kort tid etter det uttrykte Boyden og kolleger⁵ ChR2 i pattedyrnevroner og viste at de kunne bruke lyspulser til pålitelig kontroll på en millisekund tidsskala, induserehandlingspotensialer ~ 10 ms etter aktivering av ChR2 med blått lys. Optogenetiske kanaler med enda raskere kinetikk har blitt funnet nylig (f.eks. Chronos⁶).

Den grunnleggende tilnærmingen til et CRACM-eksperiment er å transfect en populasjon av antatte presynaptiske nevroner med en rekombinant adeno-assosiert virus (rAAV) som bærer genetisk informasjon for en channelrhodopsin. Transfection av nevroner med rAAV fører til uttrykk for kodet channelrhodopsin. Vanligvis er channelrhodopsin merket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescent Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), slik at transfection av nevroner i målområdet lett kan bekreftes med fluorescensavbildning. Fordi rAAVs er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potensial og langvarig genuttrykk^7,8, har de blitt en standard teknikk for å levere channelrhodopsins til nevroner. Hvis aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysblinker, etter transfeksjon av en antatt presynaptisk populasjon av nevroner, fremkaller aktivering av en kanalrhodopsin gjennom lysglimt postsynaptiske potensialer eller strømmer i målnevronene, dette er bevis på en aksonal forbindelse fra den transinfiserte kjernen til den registrerte cellen. Fordi avskårne aksoner i hjerneskiveeksperimenter kan bli drevet til å frigjøre nevrotransmitter gjennom channelrhodopsin aktivering, kjerner som ligger utenfor den akutte skive, men sende aksoner inn i postsynaptic hjerneregionen kan identifiseres med CRACM. Kraften i denne teknikken er at tilkobling og fysiologi av identifiserte langrekkevidde synaptiske innganger kan undersøkes direkte.

I tillegg til channelrhodopsins som er spennende av blått lys, etterforskere har nylig identifisert flere rød-shifted channelrhodopsins^9,10, inkludert Chrimson og dens raskere analogchrimsonR, som begge er begeistret med rødt lys av ~ 660 nm⁶. Rød-forskjøvet opsiner er av interesse fordi rødt lys trenger vev bedre enn blått lys, og rødt lys kan ha en lavere cytotoksisitet enn blått lys^10,11,12. Rød-forskjøvet channelrhodopsins også åpne opp muligheten for dual farge CRACM eksperimenter, hvor konvergens av aksoner fra forskjellige kjerner på samme nevron kan testes i ett eksperiment^6,13,14. Imidlertid viser dagens rød-forskjøvet opsins ofte uønsket kryssaktivering med blått lys^15,16,17, noe som gjør to fargeeksperimenter vanskelig. I tillegg har noen rapporter indikert at ChrimsonR gjennomgår begrenset aksonal handel, noe som kan gjøre det utfordrende å bruke ChrimsonR for CRACM eksperimenter^16,17.

Nesten alle stigende projeksjoner fra de lavere auditive hjernestammene konvergerer i den dårligere colliculus (IC), midbrain-knutepunktet til den sentrale auditive veien. Dette inkluderer projeksjoner fra cochleakjernen (CN)^18,19, det meste av det overlegne olivary-komplekset (SOC)^20,og dorsal (DNLL) og ventrale (VNLL) kjerner av lateral lemniscus²¹. I tillegg avsluttes en stor synkende projeksjon fra den hørbare cortex i IC^18,19,20^,21,22, og IC nevroner selv synapse bredt innenfor de lokale og kontralaterale fliker av IC²³. Innheking av aksoner fra mange kilder har gjort det vanskelig å sondere IC-kretser ved hjelp av elektrisk stimulering²⁴. Som et resultat, selv om nevroner i IC utføre beregninger viktig for god lokalisering og identifisering av tale og andre kommunikasjonslyder^25,26, organiseringen av nevrale kretser i IC er i stor grad ukjent. Vi har nylig identifisert VIP nevroner som den første molekylært identifiserbare nevron klassen i IC²⁷. VIP nevroner er glutamatergic stellate nevroner som projiserer til flere langdistanse mål, inkludert auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nå i stand til å bestemme kildene og funksjonen til lokale og langdistanse innganger til VIP-nevroner og for å finne ut hvordan disse kretsforbindelsene bidrar til lydbehandling.

Protokollen som presenteres her er skreddersydd for å undersøke synaptiske innganger til VIP-nevroner i IC av mus, spesielt fra kontralateral IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan enkelt tilpasses ulike inngangskilder, en annen nevrontype eller en annen hjerneregion helt. Vi viser også at ChrimsonR er en effektiv rød-shifted channelrhodopsin for lang rekkevidde krets kartlegging i den auditive hjernestammen. Vi viser imidlertid at ChrimsonR er sterkt aktivert av blått lys, selv ved lave intensiteter, og dermed å kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farge CRACM eksperimenter, må forsiktige kontroller brukes for å hindre kryssaktivering av ChrimsonR.