シナプス接続は神経回路機能にとって重要ですが、神経回路内のシナプスの正確なトポロジーと生理学は、実験的に探査することはしばしば困難です。これは、細胞電気生理学の伝統的なツールである電気刺激が、刺激部位の近くで軸索を無差別に活性化し、ほとんどの脳領域において、異なる供給源(局所的、上昇的、および/または降順)からの軸索が絡み合うからです。しかし、チャネルロドプシンアシスト回路マッピング(CRACM)1、2を使用することで^、この制限を克服することができます³.チャネルロドプシン(ChR2)は、緑色藻クラウィドマス・ラインハルティに本来見られる活性化された、カチオン選択性イオンチャネルである。ChR2は、450〜490nmの波長の青色光によって活性化され、カチオン流入を介して細胞を脱分極することができる。ChR2は、まず、ナーゲルおよび同僚⁴によってゼノプス卵母細胞で記述および発現した。その直後、Boydenたちは⁵人が哺乳類のニューロンでChR2を発現し、光パルスを使用してミリ秒のタイムスケールでスパイクを確実に制御できることを示し、青色光でChR2を活性化した後、作用電位〜10msを誘発した。さらに速い運動学を持つ光遺伝学的チャネルが最近発見されました(例えば、クロノス^6)。

CRACM実験の基本的なアプローチは、チャネルロドプシンの遺伝情報を運ぶ組換えアデノ関連ウイルス(rAAV)を用いて推定シナプス前ニューロンの集団をトランスフェクトすることです。rAAVを伴うニューロンのトランスフェクションは、コード化されたチャネルロドプシンの発現をもたらす。典型的には、チャネロドプシンはGFP(緑色蛍光タンパク質)またはtdTomato(赤色蛍光タンパク質)のような蛍光タンパク質でタグ付けされ、標的領域におけるニューロンのトランスフェクションが蛍光イメージングで容易に確認できるようになる。rAAVは非病原性であるため、炎症性の可能性が低く、長持ちする遺伝子発現^7,8は、チャネルロドプシンをニューロンに送達する標準的な技術となっている。推定シナプス前集団のニューロンのトランスフェクション後、光を介したチャレロドプシンの活性化が標的ニューロン内の後摘出電位または電流を引き起こす場合、これはトランスフェクトされた核から記録された細胞への軸索接続の証拠である。脳スライス実験で切断された軸索は、チャネロドプシン活性化を通じて神経伝達物質を放出するために駆動することができるので、急性スライスの外側にあるが、後起腺脳領域に軸索を送る核はCRACMで同定することができる。この技術の力は、同定された長距離シナプス入力の接続性および生理学を直接調査することができるということです。

青色光によって興奮性であるチャネルロドプシンに加えて、研究者は最近、Chrimsonとその高速アナログChrimsonRを含むいくつかの赤ずれたチャネルロドプシン^9、10を同定^{しました。}赤い光が青色光よりも組織に浸透し、赤色光が青色光^10、11、12よりも低い細胞毒性を有することがあるため^、赤ずれたオプシンは関心がある。赤ずされたチャネルロドプシンはまた、同じニューロン上の異なる核からの軸索の収束を1つの実験^6、13、14でテストすることができる二重色CRACM実験^の可能性を開く。しかし、現在の赤ずれたオプシンは、青色光^15,16,17で不要な交差活性化を示すことが多く、2つの色の実験が困難である。さらに、いくつかの報告は、ChrimsonRが限られた軸索密売を受けることを示しており、CRACM実験^16、17にChrimsonRを使用することは困難である可能性があります。

下聴覚脳幹核からのほぼすべての上昇予測は、中央聴覚経路の中脳ハブである下眼コリキュラス(IC)に収束する。これには、人工内核^(CN)18,19、大部分の優れたオリバリー複合体(SOC)20、側方レムニスカス²¹の後側(DNLL)および腹側(VNLL)核からの突起が含まれる。さらに、聴覚皮質からの大きな下降投影は、IC^{18、19、20、21、22}で終了し、ICニューロン自体は^IC23の局所および逆側葉内に広くシナプスを行う。多くのソースからの軸索の混ざり合いは、電気刺激²⁴を使用してIC回路を探査することが困難になっている。その結果、ICのニューロンは音声局在化や音声などの^通信音の同定に重要な計算を行^{っても、IC}における神経回路の構成はほとんど知られていない。我々は最近、IC²⁷における最初の分子的同定可能なニューロンクラスとしてVIPニューロンを同定した。VIPニューロンは、聴覚視床や優れたコリキュラスを含むいくつかの長距離標的に投影するグルタミン酸星状ニューロンである。VIPニューロンへの局所および長距離入力のソースと機能を決定し、これらの回路接続が音処理にどのように寄与するかを判断できるようになりました。

ここで提示されたプロトコルは、マウスのIC、特にコントラテータICとDCN(図1)のVIPニューロンへのシナプス入力を調査するために調整されています。プロトコルは、入力の異なるソース、異なるニューロンタイプまたはまったく異なる脳領域に簡単に適応することができます。また、ChrimsonRは、聴覚脳幹における長距離回路マッピングに有効な赤シフトチャネルロドプシンであることを示す。しかし、ChrimsonRは低強度でも青色光によって強く活性化され、したがって、2色CRACM実験でChrimsonRとクロノスを組み合わせるには、ChrimsonRのクロス活性化を防ぐために慎重な制御を使用する必要があることを実証する。