ब्लू और लाल स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन के साथ अवर कोलिकुलस न्यूरॉन्स की लंबी दूरी की चैनलोडोप्सिन-असिस्टेड सर्किट मैपिंग
Summary
चैनलोडोपसिन-असिस्टेड सर्किट मैपिंग (सीआरएसीएम) न्यूरोनके शारीरिक और/या आनुवंशिक रूप से पहचाने गए न्यूरॉन्स के समूहों के बीच लंबी दूरी के न्यूरोनल अनुमानों के कार्यात्मक मानचित्रण के लिए एक सटीक तकनीक है । यहां, हम वर्णन कैसे CRACM का उपयोग करने के लिए श्रवण brainstem कनेक्शन नक्शा, एक लाल स्थानांतरित ऑप्सिन, ChrimsonR के उपयोग सहित ।
Abstract
तंत्रिका सर्किट की जांच करते समय, इन विट्रो पैच क्लैंप दृष्टिकोण की एक मानक सीमा यह है कि कई स्रोतों से एक्सोन अक्सर इंटरमिक्स होते हैं, जिससे विद्युत उत्तेजना के साथ व्यक्तिगत स्रोतों से इनपुट को अलग करना मुश्किल हो जाता है। हालांकि, चैनलोडोपसिन असिस्टेड सर्किट मैपिंग (सीआरएसीएम) का उपयोग करके, इस सीमा को अब दूर किया जा सकता है। यहां, हम कम श्रवण ब्रेनस्टेम नाभिक और कम्मिचुअल इनपुट से आरोही इनपुट को अवर कोलिकुलस (आईसी), श्रवण प्रणाली के मिडब्रेन नाभिक में न्यूरॉन्स के एक चिन्हित वर्ग को मैप करने के लिए सीआरएसीएम का उपयोग करने की एक विधि की रिपोर्ट करते हैं। आईसी में, स्थानीय, कॉमिसरल, आरोही, और उतरते हुए अक्षों भारी जुड़े हुए हैं और इसलिए विद्युत उत्तेजना के साथ अविवेच्य हैं। एक प्रेग्नेंसी नाभिक में एक चैनलोडोपसिन की अभिव्यक्ति को चलाने के लिए एक वायरल निर्माण इंजेक्शन द्वारा, पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग के बाद चैनलोडोपसिन-व्यक्त सिनैप्टिक इनपुट की उपस्थिति और शरीर विज्ञान की विशेषता के लिए, एक विशिष्ट स्रोत से अनुमानों आईसी न्यूरॉन्स की एक विशिष्ट आबादी के लिए सेल प्रकार विशिष्ट सटीकता के साथ मैप किया जा सकता है। हम बताते हैं कि यह दृष्टिकोण क्रोनोस, नीली रोशनी से सक्रिय चैनलोडोपसिन और एक लाल-स्थानांतरित चैनलोडोपसिन, चिरिमकोनआर दोनों के साथ काम करता है। अग्रमस्तिष्क से पिछली रिपोर्टों के विपरीत, हम पाते हैं कि चिरिसोंर को पृष्ठीय कॉकलियर न्यूक्लियस प्रिंसिपल न्यूरॉन्स के अक्षतों की मजबूती से तस्करी की जाती है, यह दर्शाता है कि क्रेमसनर ब्रेनस्टेम में सीआरएसीएम प्रयोगों के लिए एक उपयोगी उपकरण हो सकता है। यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल में इंट्राक्रैनियल वायरस इंजेक्शन सर्जरी का विस्तृत विवरण शामिल है, जिसमें पृष्ठीय कॉकलियर नाभिक और चूहों के आईसी को इंजेक्शन को लक्षित करने के लिए स्टीरियोटैक्सिक निर्देशांक शामिल हैं, और पूरे सेल पैच क्लैंप रिकॉर्डिंग को कैसे मिलाएं आईसी न्यूरॉन्स के लिए लंबी दूरी के अनुमानों की जांच करने के लिए चैनलोडोपसिन सक्रियण के साथ। हालांकि इस प्रोटोकॉल आईसी के लिए श्रवण आदानों की विशेषता के अनुरूप है, यह आसानी से श्रवण brainstem और परे में अंय लंबी दूरी के अनुमानों की जांच करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
तंत्रिका सर्किट फ़ंक्शन के लिए सिनैप्टिक कनेक्शन महत्वपूर्ण हैं, लेकिन तंत्रिका सर्किट के भीतर सिनेप्स की सटीक टोपोलॉजी और शरीर विज्ञान अक्सर प्रायोगिक रूप से जांच करना मुश्किल होता है। इसका कारण यह है कि विद्युत उत्तेजना, सेलुलर इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी का पारंपरिक उपकरण, उत्तेजना साइट के पास अक्षतको सक्रिय करता है, और अधिकांश मस्तिष्क क्षेत्रों में, विभिन्न स्रोतों (स्थानीय, आरोही, और/या उतरते) इंटरट्विन से एक्सोन। हालांकि, चैनलोडोपसिन असिस्टेड सर्किट मैपिंग (सीआरएसीएम)1,2का उपयोग करके, इस सीमा को अब3से पार किया जा सकता है। चैनलोडोपसिन (ChR2) एक प्रकाश सक्रिय, कोट-चयनात्मक आयन चैनल है जो मूल रूप से हरे शैगा क्लैमाइडोमोनास रेनहार्ड्टीमें पाया जाता है। ChR2 450-490 एनएम के आसपास एक तरंगदैर्ध्य की नीली रोशनी से सक्रिय किया जा सकता है, जो कोटेशन प्रवाह के माध्यम से सेल को ध्रुवीकरण करता है। ChR2 को पहले नागेल और सहयोगियों द्वारा ज़ेनोपस ओसाइट्स में वर्णित और व्यक्त किया गया था। उसके कुछ ही समय बाद, Boyden और सहयोगियों5 स्तनधारी न्यूरॉन्स में ChR2 व्यक्त की और पता चला है कि वे प्रकाश दालों का उपयोग करने के लिए मज़बूती से एक मिलीसेकंड टाइमस्केल पर स्पाइकिंग नियंत्रण सकता है, कार्रवाई क्षमता inducing ~10 एमएस नीली रोशनी के साथ ChR2 के सक्रियण के बाद । हाल ही में (जैसे, क्रोनोस6)भी तेजी से गतिज के साथ ऑप्टोजेनेटिक चैनल पाए गए हैं।
सीआरएसीएम प्रयोग के लिए मूल दृष्टिकोण एक पुनः संयोजन एडेनो-संबद्ध वायरस (आरएएवी) के साथ ख्यात प्रेग्नेंसी न्यूरॉन्स की आबादी को स्थानांतरित करना है जो चैनलोडोपसिन के लिए आनुवंशिक जानकारी ले जाता है। आरएएवी के साथ न्यूरॉन्स का ट्रांसफेक्शन एन्कोडेड चैनलोडोप्सिन की अभिव्यक्ति की ओर जाता है। आमतौर पर, चैनलोडोप्सिन को जीएफपी (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) या टीडीमैटो (एक लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन) जैसे फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ टैग किया जाता है, ताकि लक्ष्य क्षेत्र में न्यूरॉन्स के ट्रांसफेक्शन को फ्लोरेस इमेजिंग के साथ आसानी से पुष्टि की जा सके। क्योंकि आरएएवी गैर-रोगजनक हैं, इसमें कम भड़काऊ क्षमता और लंबे समय तक चलने वाली जीन अभिव्यक्ति7,8है, वे न्यूरॉन्स को चैनलोडोप्सिन देने के लिए एक मानक तकनीक बन गए हैं। यदि, न्यूरॉन्स की ख्यात प्रेग्नेंसी आबादी के ट्रांसफेक्शन के बाद, प्रकाश चमक के माध्यम से एक चैनलोडोप्सिन की सक्रियता लक्ष्य न्यूरॉन्स में पोस्टसिनैप्टिक क्षमता या धाराओं को प्रकाश में लाना, यह ट्रांससंक्रमित नाभिक से रिकॉर्ड किए गए सेल में एक एक्सोनल कनेक्शन का सबूत है। क्योंकि मस्तिष्क टुकड़ा प्रयोगों में कटे अक्षों को चैनलोडोपसिन सक्रियण के माध्यम से न्यूरोट्रांसमीटर जारी करने के लिए प्रेरित किया जा सकता है, नाभिक जो तीव्र टुकड़ा के बाहर झूठ बोलता है लेकिन पोस्टसिनैप्टिक मस्तिष्क क्षेत्र में एक्सोन भेजता है, सीआरएसीएम के साथ पहचाना जा सकता है। इस तकनीक की शक्ति यह है कि चिन्हित लंबी दूरी के सिनैप्टिक इनपुट्स की कनेक्टिविटी और फिजियोलॉजी की सीधी जांच की जा सकती है।
नीली रोशनी से उत्तेजनीय चैनलोडोप्सिन के अलावा, जांचकर्ताओं ने हाल ही में कई लाल-स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन 9,10कीपहचान की है, जिसमें चिरिमसन और इसकी तेजी से एनालॉग चिरिमसनर शामिल हैं, दोनों ~ 660 एनएम6की लाल बत्ती से उत्साहित हैं। लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन ब्याज के होते हैं क्योंकि लाल बत्ती नीली रोशनी की तुलना में ऊतक में प्रवेश करती है, और लाल बत्ती में नीली रोशनी10,11,12की तुलना में कम साइटोटॉक्सिकिटी हो सकती है। लाल-स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन भी दोहरे रंग सीआरएसीएम प्रयोगों की संभावना को खोलते हैं, जहां एक ही न्यूरॉन पर विभिन्न नाभिक से अक्षों के अभिसरण का परीक्षण एक प्रयोग6,13,14में किया जा सकता है। हालांकि, वर्तमान लाल-स्थानांतरित ऑप्सिन अक्सर नीली रोशनी15,16,17के साथ अवांछित क्रॉस-एक्टिवेशन का प्रदर्शन करते हैं, जिससे दो रंग प्रयोग मुश्किल हो जाते हैं। इसके अलावा, कुछ रिपोर्टों में संकेत दिया गया है कि चिरिमकोनर सीमित अक्षीय तस्करी से गुजरता है, जो सीआरएसीएम प्रयोगों16,17के लिए चिरिमकोनर का उपयोग करना चुनौतीपूर्ण बना सकता है ।
निचले श्रवण ब्रेनस्टेम न्यूक्लिक नाभिक से लगभग सभी आरोही अनुमान अवर कोलिकुलस (आईसी), केंद्रीय श्रवण मार्ग के मिडब्रेन हब में एकाग्र होते हैं। इसमें कॉकलियर न्यूक्लियस (सीएन)18,19,अधिकांश सुपीरियर ओलिवार कॉम्प्लेक्स (एसओसी)20और पार्श्व लेमिनिसस21के पृष्ठीय (डीएएनएलएल) और वेंट्रल (वीएनएलएल) नाभिक के अनुमान शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, श्रवण प्रांतस्था से एक बड़ा उतरते प्रक्षेपण आईसी18,19,20,21,22में समाप्त होजाता है, और आईसी न्यूरॉन्स खुद को मोटे तौर पर आईसी23के स्थानीय और कॉन्ट्रालेटरल पालि के भीतर सिनेप्स करते हैं। कई स्रोतों से अक्षतों के आपस में मिलने से विद्युत उत्तेजना24का उपयोग करआईसी सर्किट की जांच करना मुश्किल हो गया है । नतीजतन, भले ही आईसी में न्यूरॉन्स ध्वनि स्थानीयकरण के लिए महत्वपूर्ण गणना करते हैं और भाषण और अन्य संचार की पहचान25,26लगता है, आईसी में तंत्रिका सर्किट का संगठन काफी हद तक अज्ञात है। हमने हाल ही में वीआईपी न्यूरॉन्स को आईसी27में पहली आणविक पहचानने योग्य न्यूरॉन वर्ग के रूप में पहचाना । वीआईपी न्यूरॉन्स ग्लूटामिजर स्टेलेट न्यूरॉन्स हैं जो श्रवण थैलेसीमिया और बेहतर कोलिकुलस सहित कई लंबी दूरी के लक्ष्यों को प्रोजेक्ट करते हैं। अब हम वीआईपी न्यूरॉन्स के लिए स्थानीय और लंबी दूरी की जानकारी के स्रोतों और कार्य को निर्धारित करने में सक्षम हैं और यह निर्धारित करने में सक्षम हैं कि ये सर्किट कनेक्शन ध्वनि प्रसंस्करण में कैसे योगदान देते हैं।
यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल चूहों के आईसी में वीआईपी न्यूरॉन्स के लिए सिनैप्टिक इनपुट की जांच करने के लिए सिलवाया है, विशेष रूप से कॉन्ट्रालेटरल आईसी और डीसीएन(चित्रा 1)से । प्रोटोकॉल को आसानी से इनपुट के विभिन्न स्रोतों, एक अलग न्यूरॉन प्रकार या एक अलग मस्तिष्क क्षेत्र के लिए पूरी तरह से अनुकूलित किया जा सकता है। हम यह भी बताते हैं कि चैरिसोनर श्रवण ब्रेनस्टेम में लंबी दूरी के सर्किट मानचित्रण के लिए एक प्रभावी लाल-स्थानांतरित चैनलोडोप्सिन है। हालांकि, हम प्रदर्शित करते हैं कि चिरिसोंर नीली रोशनी द्वारा दृढ़ता से सक्रिय होता है, यहां तक कि कम तीव्रता पर भी, और इस प्रकार, दो रंग सीआरएसीएम प्रयोगों में क्रोनोस के साथ चिरिसोंर को संयोजित करने के लिए, चिरिसोंर के क्रॉस-एक्टिवेशन को रोकने के लिए सावधानीपूर्वक नियंत्रण का उपयोग किया जाना चाहिए।
Protocol
Representative Results
Discussion
हमने पाया है कि CRACM माउस आईसी में न्यूरॉन्स के लिए लंबी दूरी के सिनैप्टिक इनपुट की पहचान करने और विशेषता के लिए एक शक्तिशाली तकनीक है। यहां विस्तृत प्रोटोकॉल के बाद, हमने डीसीएन और आईसी में न्यूरॉन्स के ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम को ड्यूश फोर्स्ट्सजेमेसिनस्चेफ्ट रिसर्च फेलोशिप (GO 3060/1-1, प्रोजेक्ट नंबर 401540516, डीजी को) और नेशनल इंस्टीट्यूट्स ऑफ हेल्थ ग्रांट R56 DC016880 (एमटीआर) द्वारा समर्थित किया गया था ।
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
Referências
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