מתקשר לטווח ארוך-מיפוי מעגל בסיוע של היפוקולוס נוירונים בצבע כחול ואדום הוזז
Summary
מיפוי מעגל בסיוע (CRACM) הוא טכניקה מדויקת עבור מיפוי פונקציונלי של הקרנות נוירואליות ארוכת טווח בין קבוצות מבחינה אנטומית ו/או גנטית מזוהה של נוירונים. כאן, אנו מתארים כיצד להשתמש CRACM כדי למפות את הקשרים שמיעתי גזע המוח, כולל השימוש של opsin העביר אדום, ChrimsonR.
Abstract
כאשר חוקרים את המעגלים העצביים, מגבלה סטנדרטית של הגישה מלחציים מחוץ למבחנה היא כי אקסונים ממקורות מרובים הם לעתים קרובות מעורבים, מה שמקשה על בידוד תשומות ממקורות בודדים עם גירוי חשמלי. עם זאת, על ידי שימוש במתקשרים מיפוי מעגלים (CRACM), מגבלה זו ניתן כעת להתגבר. כאן, אנו מדווחים על שיטה להשתמש ב-CRACM כדי למפות תשומות עולה מתוך גרעיני גזע שמיעתי נמוך המוח ואת תשומות מערכת למעמד מזוהה של נוירונים בתוך הקולקולוס הנחותים (IC), הגרעין המוח המימדי של מערכת השמיעה. ב-IC, מקומי, מבוקר, בסדר עולה, ויורד האקסון הם שזורים היטב ולכן ההבחנה עם גירוי חשמלי. על-ידי הזרקת מבנה ויראלי לביטוי כונן של מתקשר בגרעין טרום-סינפטית, ואחריו הקלטה של מהדק המדבקות כדי לאפיין את הנוכחות והפיזיולוגיה של מתקשרים-הבעת כניסות סינפטיות, תחזיות ממקור מסוים לאוכלוסייה מסוימת של הנוירונים IC ניתן למפות עם דיוק ספציפי לסוג תא. אנו מראים כי גישה זו פועלת עם כרונוס הן, מתקשר כחול המופעל באור, ו ChrimsonR, מתקשר אדום הוזז. בניגוד לדיווחים הקודמים מן המוח הקדמי, אנו מוצאים כי ChrimsonR הוא הנסחרות במורד האקסונים של נוירונים שבלול הראשי גרעין העיקרי, המציין כי ChrimsonR עשוי להיות כלי שימושי עבור ניסויים CRACM בגזע המוח. הפרוטוקול המוצג כאן כולל תיאורים מפורטים של ניתוח הזרקת וירוס בתוך המוח, כולל קואורדינטות סטריאוטקאית עבור זריקות המיקוד על הגרעין שבלול הראש ו IC של עכברים, וכיצד לשלב את כל ההקלטה התא השלם מהדק הקלטה עם הפעלת המתקשר כדי לחקור תחזיות לטווח ארוך כדי נוירונים IC. למרות פרוטוקול זה מותאם לאפיון תשומות שמיעתי ל-IC, זה יכול להיות מותאם בקלות כדי לחקור תחזיות לטווח ארוך אחרים בגזע השמיעה ומעבר.
Introduction
חיבורים סינפטית הם קריטיים לתפקוד המעגל העצבי, אבל הטופולוגיה המדויקת והפיזיולוגיה של הסינפסות בתוך מעגלים עצביים קשים לעתים קרובות לחקור ניסויים. הסיבה לכך היא גירוי חשמלי, הכלי המסורתי של האלקטרופיזיולוגיה התאית, הפעלת אקטונים ללא אבחנה ליד האתר גירוי, וברוב אזורי המוח, אקסונים ממקורות שונים (מקומי, עולה, ו/או יורד) משתלבים. עם זאת, על ידי שימוש במתקשרים החוצה מיפוי מעגלים (CRACM)1,2, מגבלה זו יכולה כעת להתגבר על3. מתקשר (ChR2) הוא ערוץ יון סלקטיבי המופעל באור, שנמצא במקור ב-אצה Chlamydomonas ריינהרטהירוק. ChR2 יכול להיות מופעל על ידי אור כחול של אורך הגל סביב 450-490 ננומטר, להשבית את התא באמצעות הקטיון. ChR2 תוארה לראשונה והתבטא ב קסנפוס אוציטים על ידי nagel ועמיתיו4. זמן קצר לאחר מכן, Boyden ועמיתיו5 הביע ChR2 בנוירונים מיונקים והראו כי הם יכולים להשתמש פולסים אור כדי שליטה מהימנה העולה על ציר הזמן אלפית שניה, גרימת פוטנציאל הפעולה ~ 10 ms לאחר ההפעלה של ChR2 עם אור כחול. ערוצי אלקטרואופטיקה עם קינטיקה מהירה אף יותר נמצאו לאחרונה (למשל, כרונו6).
הגישה הבסיסית לניסוי CRACM היא העברה של אוכלוסיה של נוירונים פרסינפטיים מראש עם רקומביננטי adeno הקשורים וירוס (rAAV) הנושאת את המידע הגנטי עבור המתקשר. העברה של נוירונים עם rAAV מובילה לביטוי של המתקשר המקודד. בדרך כלל, המתקשר הוא מתויג עם חלבון פלורסנט כמו GFP (חלבון פלורסנט ירוק) או tdTomato (חלבון פלורסנט אדום), כך העברה של נוירונים באזור היעד יכול בקלות להיות מאושר עם הדמיה פלואורסצנטית. מכיוון raavs הם שאינם פתוגניים, יש פוטנציאל דלקתי נמוך לאורך זמן ביטוי גנים7,8, הם הפכו טכניקה סטנדרטית כדי לספק מתקשרים לנוירונים. אם, לאחר העברת האוכלוסייה הפרסינפטיות של הנוירונים, הפעלה של מתקשר דרך גלי האור מעורר את הפוטנציאל הפוסט-סינפטיות או הזרמים בנוירונים היעד, זוהי ראיה של חיבור האקסון מן הגרעין מזוהמים אל התא המוקלט. בגלל אקסונים קטוע ניסויים במוח יכול להיות מונע כדי לשחרר נוירוטרנסמיטור באמצעות הפעלת מתקשר, גרעיני כי לשקר מחוץ לפרוסה חריפה אבל לשלוח אקסונים לתוך אזור המוח פוסטסינפטית ניתן לזהות עם CRACM. העוצמה של טכניקה זו היא כי קישוריות ופיזיולוגיה של זיהה תשומות סינפטית לטווח ארוך ניתן לחקור ישירות.
בנוסף למתקשרים שאינם מתלהבים מאור כחול, החוקרים זיהו לאחרונה מספר מתקשרים אדום-הזזה9,10, כולל Chrimson ו כchrimsonr אנלוגי מהיר שלה, שניהם נרגשים עם אור אדום של ~ 660 ננומטר6. המצב האדום-השתנה מעניין בגלל שהאור האדום חודר לרקמה יותר טוב מאור כחול, ולאור האדום אולי יש רעילות נמוכה יותר מאשר אור כחול10,11,12. מתקשר אדום הוזז גם לפתוח את האפשרות של CRACM צבע כפול ניסויים, שבו התכנסות של אקסונים מגרעינים שונים על אותו עצב ניתן לבחון בניסוי אחד6,13,14. עם זאת, הנוכחי באדום העביר opsins לעתים קרובות לא רצויות הפעלה צולבת עם אור כחול15,16,17, ביצוע שני ניסויים בצבע קשה. בנוסף, דיווחים מסוימים ציינו כי chrimsonr עובר סחר סיבי מוגבל, אשר יכול להפוך אותו מאתגר להשתמש chrimsonr עבור CRACM ניסויים16,17.
כמעט כל התחזיות העולה מן גרעיני גזע שמיעתי נמוך להתכנס בתוך הקולקולוס הנחותים (IC), רכזת המוח באמצע של מסלול השמיעה המרכזי. זה כולל התחזיות של גרעין שבלול (CN)18,19, רוב הקומפלקס olivary מעולה (SOC)20, ואת הגרעין (dnll) ו (vnll) הגרעינים של עדשת המים הצדדיים21. בנוסף, הקרנה יורדת בירידה גדולה מקליפת השמיעה מסתיימת ב-18,19,20,21,22, ו-ic הנוירונים עצמם באופן כללי בתוך האונות המקומי והפנימי של23ic. התמזגות של אקסונים ממקורות רבים הפכה את זה קשה לחקור מעגלים IC באמצעות גירוי חשמלי24. כתוצאה מכך, אף על פי שנוירונים בחישובי הביצוע הIC חשובים ללוקליזציה וזיהוי של דיבור ותקשורת אחרים נשמע25,26, הארגון של מעגלים עצביים ב IC הוא ברובו לא ידוע. לאחרונה זיהינו נוירונים VIP כמו שיעור העצב הראשון המאפשר לזיהוי הראשונה ב-IC27. הנוירונים VIP הם glutamatergic stellate נוירונים כי הפרויקט למספר מטרות ארוכות טווח, כולל תלמוס השמיעה ואת הקולקולוס מעולה. כעת אנו מסוגלים לקבוע את המקורות והתפקוד של תשומות מקומיים וארוכי טווח לנוירונים VIP ולקבוע כיצד חיבורי מעגלים אלה תורמים לעיבוד קול.
הפרוטוקול המוצג כאן הוא מותאם לחקירת תשומות סינפטית אל הנוירונים VIP ב IC של עכברים, במיוחד מ IC הצלעות ו DCN (איור 1). ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקול למקורות שונים של קלט, סוג תא שונה או אזור מוח שונה לחלוטין. אנו גם מראים כי ChrimsonR הוא מתקשר יעיל אדום העביר המתקשרים עבור מיפוי מעגלים ארוכי טווח בגזע המוח השמיעה. עם זאת, אנו מדגימים כי ChrimsonR מופעל בחוזקה על ידי אור כחול, אפילו בעוצמות נמוכות, ולכן, כדי לשלב ChrimsonR עם כרונו בשני צבעים CRACM ניסויים, פקדים זהירים חייב לשמש כדי למנוע הפעלה צולבת של ChrimsonR.
Protocol
Representative Results
Discussion
מצאנו כי CRACM היא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי ואפיון תשומות סינפטית טווח ארוך לנוירונים בעכבר IC. בעקבות הפרוטוקול המפורט כאן, השגנו העברה חזקה של נוירונים ב-DCN ו-IC, כמו גם סחר האקאליות אמין של כרונו ו ChrimsonR למסופים סינפטית ב-IC. בנוסף, הדגמנו כי טכניקה זו מאפשרת מדידה וניתוח של אירועים פוסט סינפטיו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו היתה נתמכת על ידי מלגת מחקר של הדויטשה הגרמני (GO 3060/1-1, פרויקט מספר 401540516, ל-DG) ומכונים לאומיים של מענק בריאות R56 DC016880 (MTR).
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
Referências
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genética. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. . The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
