Synaptiske forbindelser er afgørende for neurale kredsløb funktion, men den præcise topologi og fysiologi af synapser i neurale kredsløb er ofte vanskelige at sonde eksperimentelt. Dette skyldes, at elektrisk stimulation, det traditionelle værktøj af cellulær elektrofysiologi, vilkårligt aktiverer axoner nær stimulering sstedet, og i de fleste hjerneregioner, axoner fra forskellige kilder (lokale, stigende, og / eller faldende) intertwine. Ved hjælp af channelrhodopsin assisteret kredsløb kortlægning (CRACM)^1,2, denne begrænsning kan nu overvindes³. Channelrhodopsin (ChR2) er en lys aktiveret, kation-selektiv ion kanal oprindeligt findes i den grønne alga Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan aktiveres ved blåt lys af en bølgelængde omkring 450-490 nm, depolariserende cellen gennem kation tilstrømning. ChR2 blev først beskrevet og udtrykt i Xenopus oocytes af Nagel og kolleger⁴. Kort tid efter udtrykte Boyden og kolleger⁵ ChR2 i pattedyrneuroner og viste, at de kunne bruge lysimpulser til pålideligt at styre spiking på en millisekund tidsskala, inducerende virkningpotentialer ~ 10 ms efter aktivering af ChR2 med blåt lys. Optogenetiske kanaler med endnu hurtigere kinetik er blevet fundet for nylig (f.eks Chronos⁶).

Den grundlæggende tilgang til en CRACM eksperiment er at transfect en befolkning af formodede presynaptic neuroner med en rekombinant adeno-associeret virus (rAAV), der bærer den genetiske information til en kanalrhodopsin. Transfection af neuroner med rAAV fører til udtryk for den kodede channelrhodopsin. Typisk er kanalrhodopsin mærket med et fluorescerende protein som GFP (Green Fluorescerende Protein) eller tdTomato (et rødt fluorescerende protein), således at transfection af neuroner i målregionen nemt kan bekræftes med fluorescensbilleddannelse. Fordi rAV’er er ikke-patogene, har et lavt inflammatorisk potentiale og langvarig genekspression^7,8, er de blevet en standard teknik til at levere kanalrhodopsins til neuroner. Hvis aktivering af en kanalrhodopsin gennem lysblinker efter transfection af en formodet presynaptisk population af neuroner fremkalder postsynaptiske potentialer eller strømme i målneuronerne, hvilket er tegn på en axonal forbindelse fra den transfunderede kerne til den registrerede celle. Fordi afhuggede axoner i hjernen skive eksperimenter kan køres til at frigive neurotransmitter gennem channelrhodopsin aktivering, kerner, der ligger uden for den akutte skive, men sende axoner ind i postsynaptiske hjerne regionen kan identificeres med CRACM. Kraften i denne teknik er, at tilslutning og fysiologi af identificerede langtrækkende synaptiske input kan undersøges direkte.

Ud over kanalrhodopsins, der er excitable af blåt lys, efterforskere har for nylig identificeret flere rød-flyttet channelrhodopsins^9,10, herunder Chrimson og dens hurtigere analogChrimsonR, som begge er begejstrede med rødt lys på ~ 660 nm⁶. Rød-skiftede opsins er af interesse, fordi rødt lys trænger væv bedre end blåt lys, og rødt lys kan have en lavere cytotoksicitet end blåt lys^10,11,12. Rød-flyttet channelrhodopsins også åbne mulighed for dobbelt farve CRACM eksperimenter, hvor konvergensen af axoner fra forskellige kerner på samme neuron kan testes i et eksperiment^6,13,14. Men, nuværende rød-skiftede opsins ofte udviser uønsket krydsaktivering med blåt lys^15,16,17, hvilket gør to farveeksperimenter vanskelig. Desuden har nogle rapporter vist, at ChrimsonR gennemgår begrænset axonal handel, hvilket kan gøre det udfordrende at bruge ChrimsonR til CRACM eksperimenter^16,17.

Næsten alle stigende fremskrivninger fra den lavere auditive hjernestammen kerner konvergerer i ringere colliculus (IC), midthjernen hub af den centrale auditive vej. Dette omfatter fremskrivninger fra cochlear kernen (CN)^18,19, det meste af det overlegne olivary kompleks (SOC)²⁰, og ryg (DNLL) og ventral (VNLL) kerner af den laterale lemniscus²¹. Derudover en stor faldende fremskrivning fra den auditive cortex ophører i IC^{18,19,20,21,22}, og IC neuroner selv synapse bredt inden for de lokale og kontralaterale lapper af IC²³. Sammenblanding af axoner fra mange kilder har gjort det vanskeligt at sonde IC kredsløb ved hjælp af elektrisk stimulation²⁴. Som et resultat, selv om neuroner i IC udføre beregninger vigtigt for lyd lokalisering og identifikation af tale og anden kommunikation lyde^25,26, organiseringen af neurale kredsløb i IC er stort set ukendt. Vi har for nylig identificeret VIP neuroner som den første molekylært identificerbare neuron klasse i IC^27. VIP neuroner er glutamatergic stellate neuroner, der projektet til flere langtrækkende mål, herunder auditive thalamus og overlegen colliculus. Vi er nu i stand til at bestemme kilderne til og funktionen af lokale og langtrækkende input til VIP neuroner og til at bestemme, hvordan disse kredsløb forbindelser bidrager til lydbehandling.

Protokollen præsenteres her er skræddersyet til at undersøge synaptiske input til VIP neuroner i IC af mus, specielt fra den kontralaterale IC og DCN (Figur 1). Protokollen kan nemt tilpasses forskellige kilder til input, en anden neuron type eller en anden hjerne region helt. Vi viser også, at ChrimsonR er en effektiv rød-flyttet kanalrhodopsin for langtrækkende kredsløb kortlægning i auditive hjernestammen. Men vi viser, at ChrimsonR er stærkt aktiveret af blåt lys, selv ved lave intensiteter, og dermed, at kombinere ChrimsonR med Chronos i to-farve CRACM eksperimenter, omhyggeligkontrol skal bruges til at forhindre krydsaktivering af ChrimsonR.