Lange afstand Channelrhodopsin-assisted Circuit Mapping van inferieure Colliculus Neuronen met blauwe en rood-verschoven Channelrhodopsinen

Synaptische verbindingen zijn van cruciaal belang voor neurale circuitfunctie, maar de precieze topologie en fysiologie van synapsen binnen neurale circuits zijn vaak moeilijk experimenteel te onderzoeken. Dit komt omdat elektrische stimulatie, het traditionele instrument van cellulaire elektrofysiologie, lukraak axonen activeert in de buurt van de stimulatiesite, en in de meeste hersengebieden verstrengelen axonen uit verschillende bronnen (lokaal, oplopend en/of dalend). Echter, met behulp van channelrhodopsin assisted circuit mapping (CRACM)^1,2, kan deze beperking nu worden overwonnen³. Channelrhodopsine (ChR2) is een licht geactiveerd, kation-selectieve ionenkanaal oorspronkelijk gevonden in de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 kan worden geactiveerd door blauw licht van een golflengte rond 450-490 nm, depolariseren van de cel door middel van kation instroom. ChR2 werd voor het eerst beschreven en uitgedrukt in Xenopus eicellen door Nagel en collega’s⁴. Kort daarna, Boyden en collega’s⁵ uitgedrukt ChR2 in zoogdierneuronen en toonde aan dat ze lichtpulsen konden gebruiken om betrouwbaar controle spiking op een milliseconde tijdschaal, inducerende actie potentials ~ 10 ms na activering van ChR2 met blauw licht. Optogenetische kanalen met nog snellere kinetiek zijn onlangs gevonden (bijvoorbeeld Chronos⁶).

De basisbenadering van een CRACM-experiment is om een populatie van vermeende presynaptische neuronen te transfectmet een recombinant adeno-geassocieerd virus (rAAV) dat de genetische informatie voor een channelrhodopsine draagt. Transfection van neuronen met rAAV leidt tot de expressie van de gecodeerde channelrhodopsine. Typisch, de channelrhodopsine is gelabeld met een fluorescerend eiwit zoals GFP (Green Fluorescent Protein) of tdTomato (een rood fluorescerend eiwit), zodat transfection van neuronen in het doelgebied gemakkelijk kan worden bevestigd met fluorescentie beeldvorming. Omdat rAAVs niet-pathogene zijn, een laag ontstekingspotentieel hebben en langdurige genexpressie^7,8, zijn ze een standaardtechniek geworden om channelrhodopsinen aan neuronen te leveren. Als, na transfection van een vermeende presynaptische populatie van neuronen, activering van een channelrhodopsine door middel van lichtflitsen lokt postsynaptische potentialen of stromingen in de doelneuronen, dit is het bewijs van een axonale verbinding van de transfected kern naar de geregistreerde cel. Omdat afgehakte axonen in hersenslice experimenten kunnen worden gedreven om neurotransmitter release door middel van channelrhodopsine activering, kernen die buiten de acute slice liggen, maar stuur axonen in de postsynaptische hersengebied kan worden geïdentificeerd met CRACM. De kracht van deze techniek is dat de connectiviteit en fysiologie van geïdentificeerde synaptische ingangen over lange afstand direct kunnen worden onderzocht.

In aanvulling op channelrhodopsins die prikkelbaar zijn door blauw licht, onderzoekers hebben onlangs geïdentificeerd verschillende rood-verschoven channelrhodopsins^9,10, met inbegrip van Chrimson en zijn snellere analoge ChrimsonR, die beide zijn enthousiast met rood licht van ~ 660 nm⁶. Roodverschoven opsinen zijn van belang omdat rood licht weefsel beter doordringt dan blauw licht, en rood licht kan een lagere cytotoxiciteit hebben dan blauw licht^10,11,12. Rood verschoven channelrhodopsinen openen ook de mogelijkheid van dual color CRACM experimenten, waarbij de convergentie van axonen uit verschillende kernen op hetzelfde neuron kan worden getest in een experiment^6,13,14. Echter, de huidige rood-verschoven opsins vertonen vaak ongewenste kruisactivering met blauw licht^15,16,17, waardoor twee kleur experimenten moeilijk. Bovendien hebben sommige rapporten aangegeven dat ChrimsonR beperkte axonale handel ondergaat, wat het moeilijk kan maken om ChrimsonR te gebruiken voor CRACM-experimenten^16,17.

Bijna alle opgaande projecties van de lagere auditieve hersenstamkernen komen samen in de inferieure colliculus (IC), de midbrain hub van de centrale auditieve route. Dit omvat projecties van de cochleaire kern (CN)^18,19, het grootste deel van het superieure olivariecomplex (SOC)²⁰, en de dorsale (DNLL) en ventrale (VNLL) kernen van de laterale lemniscus²¹. Bovendien eindigt een grote dalende projectie van de auditieve cortex in de IC^{18,19,20,21,22}, en IC-neuronen zelf synaps breed binnen de lokale en contralaterale kwabben van de IC²³. Het vermengen van axonen uit vele bronnen heeft het moeilijk gemaakt om IC-circuits te sondemeten met behulp van elektrische stimulatie²⁴. Als gevolg daarvan, hoewel neuronen in de IC berekeningen uit te voeren belangrijk voor geluidslokalisatie en de identificatie van spraak en andere communicatie geluiden^25,26, de organisatie van neurale circuits in de IC is grotendeels onbekend. We hebben onlangs geïdentificeerd VIP neuronen als de eerste moleculair identificeerbare neuron klasse in de IC²⁷. VIP-neuronen zijn glutamatergic stellate neuronen die projecteren op verschillende lange-afstandsdoelen, waaronder de auditieve thalamus en superieure colliculus. We zijn nu in staat om de bronnen en functie van lokale en lange-afstandsingangen voor VIP-neuronen te bepalen en te bepalen hoe deze circuitverbindingen bijdragen aan geluidsverwerking.

Het hier gepresenteerde protocol is afgestemd op het onderzoeken van synaptische ingangen van VIP-neuronen in de IC van muizen, met name van de contralaterale IC en de DCN (Figuur 1). Het protocol kan gemakkelijk worden aangepast aan verschillende bronnen van input, een ander neuron type of een ander hersengebied helemaal. We laten ook zien dat ChrimsonR een effectieve roodverschoven kanaalrhodopsine is voor lange afstand circuit mapping in de auditieve hersenstam. We tonen echter aan dat ChrimsonR sterk wordt geactiveerd door blauw licht, zelfs bij lage intensiteiten, en dus, om ChrimsonR te combineren met Chronos in tweekleurige CRACM-experimenten, moeten zorgvuldige controles worden gebruikt om kruisactivering van ChrimsonR te voorkomen.