Las conexiones sinápticas son críticas para la función del circuito neural, pero la topología precisa y la fisiología de las sinapsis dentro de los circuitos neuronales a menudo son difíciles de sondear experimentalmente. Esto se debe a que la estimulación eléctrica, la herramienta tradicional de la electrofisiología celular, activa indiscriminadamente los axones cerca del sitio de estimulación, y en la mayoría de las regiones cerebrales, los axones de diferentes fuentes (locales, ascendentes y/o descendentes) se entrelazan. Sin embargo, mediante el uso de channelrhodopsin asignación de circuito asistido (CRACM)^1,2, esta limitación ahora se puede superar³. Channelrhodopsin (ChR2) es un canal iónico activado por la luz, selectivo de cationes originalmente encontrado en la alga verde Chlamydomonas reinhardtii. ChR2 se puede activar por luz azul de una longitud de onda alrededor de 450-490 nm, despolarizando la célula a través de la afluencia catiónica. ChR2 fue descrito y expresado por primera vez en ovocitos de Xenopus por Nagel y sus colegas^4. Poco después, Boyden y sus colegas⁵ expresaron ChR2 en neuronas de mamíferos y demostraron que podían usar pulsos de luz para controlar de forma fiable el pico en una escala de tiempo de milisegundos, induciendo potenciales de acción de 10 ms después de la activación de ChR2 con luz azul. Recientemente se han encontrado canales optogenéticos con cinética aún más rápida (por ejemplo, Chronos⁶).

El enfoque básico de un experimento craCM es transfectar una población de neuronas hipotápticas putativas con un virus adeno-asociado recombinante (rAAV) que lleva la información genética para un canalrhodopsin. La transfección de las neuronas con rAAV conduce a la expresión de la canalrodonina codificada. Típicamente, la canalrhodopsina se etiqueta con una proteína fluorescente como GFP (Proteína Fluorescente Verde) o tdTomato (una proteína fluorescente roja), por lo que la transfección de las neuronas en la región objetivo se puede confirmar fácilmente con imágenes de fluorescencia. Debido a que los ARV no son patógenos, tienen un bajo potencial inflamatorio y expresión génica de larga duración^7,8, se han convertido en una técnica estándar para entregar clasrodoninas a las neuronas. Si, después de la transfección de una población presináptica putativa de neuronas, la activación de una cedrodrodina a través de destellos de luz provoca potenciales o corrientes postsinápticas en las neuronas objetivo, esto es evidencia de una conexión axonal desde el núcleo transfected a la célula registrada. Debido a que los axones cortados en experimentos de corte de cerebro pueden ser conducidos a liberar neurotransmisor a través de la activación de la cifrodonina, los núcleos que se encuentran fuera de la rebanada aguda pero envían axones a la región del cerebro postsináptico se pueden identificar con CRACM. El poder de esta técnica es que la conectividad y la fisiología de las entradas sinápticas de largo alcance identificadas se pueden investigar directamente.

Además de las cedrodoninas que son excitables por la luz azul, los investigadores han identificado recientemente varias channelrhodopsins de cambio rojo^9,10,incluyendo Chrimson y su ChrimsonR analógico más rápido, los cuales están excitados con luz roja de 660 nm⁶. Las opsins de cambio rojo son de interés porque la luz roja penetra mejor en el tejido que la luz azul, y la luz roja puede tener una citotoxicidad inferior a la luz azul^10,11,12. Las cardrepsinas de cambio rojo también abren la posibilidad de experimentos CRACM de doble color, donde la convergencia de axones de diferentes núcleos en la misma neurona se puede probar en un experimento^6,13,14. Sin embargo, las operaciones actuales de cambio rojo a menudo exhiben activación cruzada no deseada con luz azul^15,16,17, lo que dificulta dos experimentos de color. Además, algunos informes han indicado que ChrimsonR se somete a un tráfico axonal limitado, lo que puede dificultar el uso de ChrimsonR para experimentos CRACM^16,17.

Casi todas las proyecciones ascendentes de los núcleos del tronco cerebral auditivo inferior convergen en el colículo inferior (IC), el centro del cerebro medio de la vía auditiva central. Esto incluye proyecciones del núcleo coclear (CN)^18,19, la mayor parte del complejo olivar superior (SOC)^20,y los núcleos dorsal (DNLL) y ventral (VNLL) del lemnisco lateral^21. Además, una gran proyección descendente de la corteza auditiva termina en el IC^{18,19,20,21,22,}y las neuronas IC sí mismas sinapsis ampliamente dentro de los lóbulos locales y contralaterales del IC²³. La mezcla de axónes de muchas fuentes ha hecho difícil sondear circuitos IC utilizando la estimulación eléctrica^24. Como resultado, a pesar de que las neuronas en el IC realizan cálculos importantes para la localización del sonido y la identificación del habla y otros sonidos de comunicación^25,26, la organización de los circuitos neuronales en el IC es en gran medida desconocida. Recientemente identificamos las neuronas VIP como la primera clase de neuronas identificables molecularmente en el IC^27. Las neuronas VIP son neuronas estelares glutamatérgicas que se proyectan a varios objetivos de largo alcance, incluyendo el tálamo auditivo y el colículo superior. Ahora somos capaces de determinar las fuentes y la función de las entradas locales y de largo alcance a las neuronas VIP y determinar cómo estas conexiones de circuito contribuyen al procesamiento de sonido.

El protocolo presentado aquí está diseñado para investigar las entradas sinápticas a las neuronas VIP en el IC de los ratones, específicamente desde el IC contralateral y el DCN(Figura 1). El protocolo se puede adaptar fácilmente a diferentes fuentes de entrada, un tipo de neurona diferente o una región cerebral diferente en conjunto. También mostramos que ChrimsonR es un canal de cambio rojo eficaz para el mapeo de circuitos de largo alcance en el tronco encefálico auditivo. Sin embargo, demostramos que ChrimsonR está fuertemente activado por la luz azul, incluso a bajas intensidades, y por lo tanto, para combinar ChrimsonR con Chronos en experimentos CRACM de dos colores, se deben utilizar controles cuidadosos para evitar la activación cruzada de ChrimsonR.