طويلة المدى Channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر من الخلايا العصبية الدنيا Colliculus مع الأزرق والأحمر تحول Channelrhodopsins
Summary
رسم خرائط الدوائر بمساعدة Channelrhodopsin (CRACM) هو تقنية دقيقة لرسم الخرائط الوظيفية للإسقاطات العصبية بعيدة المدى بين مجموعات الخلايا العصبية المحددة تشريحياو/ أو وراثيا. هنا ، ونحن نصف كيفية استخدام CRACM لرسم خريطة وصلات جذع الدماغ السمعية ، بما في ذلك استخدام أوبسين أحمر التحول ، ChrimsonR.
Abstract
عند التحقيق في الدوائر العصبية ، فإن القيد القياسي لنهج المشبك في المختبر هو أن المحاور من مصادر متعددة غالبًا ما تكون مختلطة ، مما يجعل من الصعب عزل المدخلات من المصادر الفردية مع التحفيز الكهربائي. ومع ذلك، باستخدام channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدائرة (CRACM)، يمكن الآن التغلب على هذا القيد. هنا، نبلغ عن طريقة لاستخدام CRACM لرسم خريطة المدخلات التصاعدية من نواة جذع الدماغ السمعي السفلي والمدخلات الجماعية إلى فئة محددة من الخلايا العصبية في الكوليكولوس السفلي (IC)، نواة الدماغ المتوسط للنظام السمعي. في IC ، تكون المحاور المحورية المحلية والمندوبية والصاعدة والتنازلية متشابكة بشكل كبير وبالتالي لا يمكن تمييزها مع التحفيز الكهربائي. عن طريق حقن بناء الفيروسية لدفع التعبير عن channelrhodopsin في نواة presynaptic، تليها تسجيل المشبك التصحيح لتوصيف وجود وعلم وظائف الأعضاء من المدخلات متشابك عبر channelrhodopsin، والإسقاطات من مصدر معين يمكن تعيين إلى مجموعة محددة من الخلايا العصبية IC مع دقة نوع الخلية محددة. نظهر أن هذا النهج يعمل مع كل من كرونوس، قناة زرقاء تنشيط الضوء، وChrimsonR، قناة حمراء تحول. على النقيض من التقارير السابقة من الدماغ الأمامي، نجد أن يتم الاتجار بقوة ChrimsonR أسفل محاور عصبية الخلايا العصبية الرئيسية نواة القوقعة الظهرية، مشيرا إلى أن ChrimsonR قد تكون أداة مفيدة لتجارب CRACM في جذع الدماغ. يتضمن البروتوكول المعروض هنا وصفًا تفصيليًا لجراحة حقن الفيروسات داخل الجمجمة ، بما في ذلك إحداثيات stereotaxic لاستهداف الحقن إلى نواة القوقعة الهروية وIC للفئران ، وكيفية الجمع بين تسجيل المشبك المشبك في الخلايا الكاملة مع تنشيط channelrhodopsin للتحقيق في التوقعات بعيدة المدى للخلايا العصبية IC. على الرغم من أن هذا البروتوكول مصمم خصيصًا لتوصيف المدخلات السمعية للIC ، إلا أنه يمكن تكييفه بسهولة للتحقيق في الإسقاطات الأخرى طويلة المدى في جذع الدماغ السمعي وما بعده.
Introduction
اتصالات متشابك ة حاسمة لوظيفة الدائرة العصبية، ولكن طوبولوجيا دقيقة وعلم وظائف الأعضاء من نقاط الاشتباك العصبي داخل الدوائر العصبية غالبا ما يكون من الصعب التحقيق تجريبيا. وذلك لأن التحفيز الكهربائي ، الأداة التقليدية للفيزيولوجيا الكهربائية الخلوية ، ينشط بشكل عشوائي محاور عصبية بالقرب من موقع التحفيز ، وفي معظم مناطق الدماغ ، تتشابك المحاور من مصادر مختلفة (محلية ، تصاعدية ، و / أو تنازلية). ومع ذلك ، باستخدام channelrhodopsin بمساعدة رسم خرائط الدوائر (CRACM)1،2، يمكن الآن التغلب على هذا القيد3. Channelrhodopsin (ChR2) هو ضوء تنشيط, قناة أيون انتقائية الميشن وجدت أصلا في الأخضر الغا Chlamydomonas reinhardtii. يمكن تنشيط ChR2 بواسطة الضوء الأزرق من الطول الموجي حول 450-490 نانومتر، وإزالة الاستقطاب الخلية من خلال تدفق التكيّف. تم وصف ChR2 لأول مرة وأعرب عنها في البويضات Xenopus من قبل ناجيل وزملاؤه4. بعد ذلك بوقت قصير، أعرب بويدن وزملاؤه5 ChR2 في الخلايا العصبية الثديية وأظهرت أنها يمكن أن تستخدم نبضات الضوء للسيطرة بشكل موثوق على spiking على مقياس زمني ميلي ثانية، مما أدى إلى إمكانات العمل ~ 10 مللي بعد تفعيل ChR2 مع الضوء الأزرق. تم العثور على قنوات البوجينية مع حركية أسرع في الآونة الأخيرة (على سبيل المثال ، Chronos6).
النهج الأساسي لتجربة CRACM هو نقل مجموعة من الخلايا العصبية presynaptic المفترضة مع فيروس الأدينو المرتبطة بالمؤتلف (rAAV) الذي يحمل المعلومات الوراثية لقناة rhorhodopsin. Transfection من الخلايا العصبية مع rAAV يؤدي إلى التعبير عن channelrhodopsin المشفرة. عادة، يتم وضع علامة channelrhodopsin مع بروتين الفلورسنت مثل GFP (البروتين الفلورسنت الأخضر) أو tdTomato (بروتين الفلورسنت الأحمر)، بحيث يمكن بسهولة أن يتم تأكيد transfection من الخلايا العصبية في المنطقة المستهدفة مع التصوير الفلوري. لأن rAAVs غير المسببة للأمراض، لديها إمكانات التهابية منخفضة وطويلة الأمد التعبير الجيني7،8، أصبحت تقنية قياسية لتسليم channelrhodopsins إلى الخلايا العصبية. إذا، بعد نقل السكان presynaptic المفترضة من الخلايا العصبية، وتفعيل channelrhodopsin من خلال ومضات الضوء يثير الإمكانات أو التيارات postynaptic في الخلايا العصبية المستهدفة، وهذا هو دليل على اتصال محور عصبي من النواة المنقولة إلى الخلية المسجلة. لأن محاور عصبية مقطوعة في تجارب شريحة الدماغ يمكن أن تكون مدفوعة لإطلاق الناقل العصبي من خلال تنشيط channelrhodopsin, يمكن التعرف على النوى التي تقع خارج شريحة حادة ولكن إرسال محاور عصبية في منطقة الدماغ postynaptic مع CRACM. قوة هذه التقنية هو أن الاتصال وعلم وظائف الأعضاء من المدخلات متشابك المدى الطويل المحدد يمكن التحقيق مباشرة.
بالإضافة إلى channelrhodopsins التي هي منفعل من الضوء الأزرق، وقد حددت المحققين مؤخرا العديد من channelrhodopsins الأحمر تحول9،10، بما في ذلك Chrimson وأسرع ChrimsonR التناظرية، وكلاهما متحمس مع الضوء الأحمر من ~ 660 نانومتر6. الأوبسينات الحمراء المتحولة هي ذات فائدة لأن الضوء الأحمر يخترق الأنسجة أفضل من الضوء الأزرق ، والضوء الأحمر قد يكون له سمية سيتانية أقل من الضوء الأزرق10،11،12. قناة حمراء تحول أيضا فتح إمكانية تجارب CRACM اللون المزدوج، حيث يمكن اختبار التقارب بين محاور عصبية من نوى مختلفة على نفس الخلايا العصبية في تجربة واحدة6،13،14. ومع ذلك ، فإن opsins الحالية ذات التحول الأحمر غالبًا ما تعرض تنشيطًا متقاطعًا غير مرغوب فيه مع الضوء الأزرق15،16،17، مما يجعل تجربتين لونيتين صعبتين. وبالإضافة إلى ذلك، أشارت بعض التقارير إلى أن ChrimsonR يخضع للاتجار المحوري محدودة، والتي يمكن أن تجعل من الصعب استخدام ChrimsonR لتجارب CRACM16،17.
تقريبا جميع التوقعات التصاعدية من نواة جذع الدماغ السمعي السفلي تتلاقى في الكوليكولوس السفلي (IC)، محور منتصف الدماغ للمسار السمعي المركزي. وهذا يشمل الإسقاطات من نواة القوقعة (CN)18،19، معظم مجمع القلة العليا (SOC)20، والظهرية (DNLL) والبطنية (VNLL) نواة lemniscus الجانبية21. بالإضافة إلى ذلك، إسقاط تنازلي كبير من القشرة السمعية ينتهي في IC18،19،21،22،والخلايا العصبية IC أنفسهم متشابكة على نطاق واسع داخل الفصوص المحلية ومضادة للIC23. وقد جعل اختلاط المحاور من مصادر عديدة من الصعب التحقيق الدوائر IC باستخدام التحفيز الكهربائي24. ونتيجة لذلك، على الرغم من الخلايا العصبية في IC أداء حسابات هامة لتوطين الصوت وتحديد الكلام والاتصالات الأخرى الأصوات25،26، وتنظيم الدوائر العصبية في IC غير معروف إلى حد كبير. لقد حددنا مؤخرًا الخلايا العصبية VIP كأول فئة عصبية يمكن تحديدها جزيئيًا في IC27. الخلايا العصبية VIP هي الخلايا العصبية ستيلاتي الجلوتامات التي مشروع إلى العديد من الأهداف بعيدة المدى, بما في ذلك المهاد السمعيو وcolliculus متفوقة. ونحن الآن قادرون على تحديد مصادر ووظيفة المدخلات المحلية وطويلة المدى للخلايا العصبية VIP وتحديد كيفية هذه الاتصالات الدائرة تسهم في معالجة الصوت.
البروتوكول المعروض هنا مصمم للتحقيق في المدخلات متشابك للخلايا العصبية VIP في IC من الفئران، وتحديدا من IC المعضدة وDCN(الشكل 1). يمكن تكييف البروتوكول بسهولة مع مصادر مختلفة من المدخلات، نوع الخلايا العصبية المختلفة أو منطقة الدماغ مختلفة تماما. نظهر أيضا أن ChrimsonR هو قناة فعالة حمراء تحول rhodopsin لرسم خرائط الدوائر طويلة المدى في جذع الدماغ السمعي. ومع ذلك، نحن نثبت أن يتم تنشيط ChrimsonR بقوة من الضوء الأزرق، حتى في كثافة منخفضة، وبالتالي، للجمع بين ChrimsonR مع كرونوس في تجارب CRACM لونين، يجب استخدام ضوابط دقيقة لمنع التنشيط المتبادل من ChrimsonR.
Protocol
Representative Results
Discussion
لقد وجدنا أن CRACM هو تقنية قوية لتحديد ووصف المدخلات متشابك المدى الطويل إلى الخلايا العصبية في IC الماوس. بعد البروتوكول المفصل هنا ، حققنا نقل قوي للخلايا العصبية في DCN و IC بالإضافة إلى الاتجار المحوري الموثوق به من Chronos و ChrimsonR إلى المحطات المتشابكة في IC. بالإضافة إلى ذلك ، أثبتنا أن هذه الت?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من قبل زمالة دويتشه فورشونججماينشافت للأبحاث (GO 3060/1-1، رقم المشروع 401540516، إلى DG) والمعاهد الوطنية للصحة منحة R56 DC016880 (MTR).
Materials
| AAV1.Syn.ChrimsonR-tdTomato.WPRE.bGH | Addgene | 59171-AAV1 | |
| AAV1.Syn.Chronos-GFP.WPRE.bGH | Addgene | 59170-AAV1 | |
| Ai14 reporter mice (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J) | Jackson Laboratory | stock #007914 | |
| Amber (590nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-A8 | |
| Blue (470nm) LUXEON Rebel LED | Luxeon Star LEDs | SP-01-B4 | |
| Carproject (carprofen) | Henry Schein Animal Health | 59149 | |
| Drummond glas capillaries | Drummond Scientific Company | 3-000-203-G/X | |
| Drummond Nanoject 3 | Drummond Scientific Company | 3-300-207 | |
| Electrode beveler | Sutter Instrument | FG-BV10-D | |
| Ethilon 6-0 (0.8 metric) nylon sutures | Ethicon | local pharmacy | |
| Fixed stage microscope | any | n/a | |
| Gas anesthesia head holder | David Kopf Instruments | 933-B | |
| General surgery tools | Fine Science Tools | N/A | |
| Golden A5 pet clipper | Oster | 078005-010-003 | |
| Heating pad | Custom build | N/A | |
| Hooded induction chamber w/ vacuum system | Patterson Scientific | 78917760 | |
| Hot bead sterilizer Steri 250 | Inotech | IS-250 | |
| Iodine solution 10% | MedChoice | local pharmacy | |
| Isoflurane vaporizer | Patterson Scientific | 07-8703592 | |
| Lidocain topical jelly 2% | Akorn | local pharmacy | |
| Micro motor drill 1050 | Henry Schein Animal Health | 7094351 | |
| Micro motor drill bits 0.5 mm | Fine Science Tools | 19007-05 | |
| Motorized Micromanipulator | Sutter Instrument | MP-285/R | |
| Ophthalmic ointment Artificial Tears | Akorn | local pharmacy | |
| P-1000 electrode puller | Sutter Instrument | P-1000 | |
| Patch clamp amplifier incl data acquisition software | any | n/a | |
| Portable anethesia machine | Patterson Scientific | 07-8914724 | |
| Small animal steroetaxic frame | David Kopf Instruments | 930-B | |
| Standard chemicals | local vendors | N/A | |
| standard imaging solutions | |||
| Sterile towel drapes | Dynarex | 4410 | |
| Surgical marker | Fine Science Tools | 18000-30 | |
| Temperature controller | Custom build | N/A | |
| Vibratome | any | n/a | |
| VIP-IRES-Cre mice (Viptm1(cre)Zjh/J) | Jackson Laboratory | stock #010908 | |
| Water bath | any | n/a |
Referências
- Petreanu, L., Huber, D., Sobczyk, A., Svoboda, K. Channelrhodopsin-2-assisted circuit mapping of long-range callosal projections. Nature Neuroscience. 10, 663-668 (2007).
- Atasoy, D., Aponte, Y., Su, H. H., Sternson, S. M. A FLEX Switch Targets Channelrhodopsin-2 to Multiple Cell Types for Imaging and Long-Range Circuit Mapping. Journal of Neuroscience. 28, 7025-7030 (2008).
- Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8, 26-29 (2011).
- Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100, 13940-13945 (2003).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8, 1263-1268 (2005).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature Methods. 11, 338-346 (2014).
- Flotte, T. R. Gene Therapy Progress and Prospects: Recombinant adeno-associated virus (rAAV) vectors. Gene Therapy. 11, 805-810 (2004).
- Aponte-Ubillus, J. J., et al. Molecular design for recombinant adeno-associated virus (rAAV) vector production. Applied Microbiology and Biotechnology. 102, 1045-1054 (2018).
- Kim, C. K., et al. Simultaneous fast measurement of circuit dynamics at multiple sites across the mammalian brain. Nature Methods. 13, 325-328 (2016).
- Lin, J. Y., Knutsen, P. M., Muller, A., Kleinfeld, D., Tsien, R. Y. ReaChR: a red-shifted variant of channelrhodopsin enables deep transcranial optogenetic excitation. Nature Neuroscience. 16, 1499-1508 (2013).
- Mager, T., et al. High frequency neural spiking and auditory signaling by ultrafast red-shifted optogenetics. Nature Communications. 9, (2018).
- Oda, K., et al. Crystal structure of the red light-activated channelrhodopsin Chrimson. Nature Communications. 9, (2018).
- Hooks, B. M. Dual-Channel Photostimulation for Independent Excitation of Two Populations. Current Protocols in Neuroscience. 85, e52 (2018).
- Schild, L. C., Glauser, D. A. Dual Color Neural Activation and Behavior Control with Chrimson and CoChR in Caenorhabditis elegans. Genética. 200, 1029-1034 (2015).
- Rost, B. R., Schneider-Warme, F., Schmitz, D., Hegemann, P. Optogenetic Tools for Subcellular Applications in Neuroscience. Neuron. 96, 572-603 (2017).
- Maimon, B. E., Sparks, K., Srinivasan, S., Zorzos, A. N., Herr, H. M. Spectrally distinct channelrhodopsins for two-colour optogenetic peripheral nerve stimulation. Nature Biomedical Engineering. 2, 485 (2018).
- Asrican, B., et al. Next-generation transgenic mice for optogenetic analysis of neural circuits. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Oliver, D. L. Dorsal cochlear nucleus projections to the inferior colliculus in the cat: A light and electron microscopic study. Journal of Comparative Neurology. 224, 155-172 (1984).
- Oliver, D. L. Projections to the inferior colliculus from the anteroventral cochlear nucleus in the cat: Possible substrates for binaural interaction. Journal of Comparative Neurology. 264, 24-46 (1987).
- Glendenning, K. K., Masterton, R. B. Acoustic chiasm: efferent projections of the lateral superior olive. Journal of Neuroscience. 3, 1521-1537 (1983).
- Adams, J. C. Ascending projections to the inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 183, (1979).
- Winer, J. A., Larue, D. T., Diehl, J. J., Hefti, B. J. Auditory cortical projections to the cat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 400, 147-174 (1998).
- Saldaña, E., Merchań, M. A. Intrinsic and commissural connections of the rat inferior colliculus. Journal of Comparative Neurology. 319, 417-437 (1992).
- Sivaramakrishnan, S., Sanchez, J. T., Grimsley, C. A. High concentrations of divalent cations isolate monosynaptic inputs from local circuits in the auditory midbrain. Frontiers in Neural Circuits. 7, (2013).
- Felix, R. A., Gourévitch, B., Portfors, C. V. Subcortical pathways: Towards a better understanding of auditory disorders. Hearing Research. 362, 48-60 (2018).
- Winer, J. A., Schreiner, C., Winer, J. A., Schreiner, C., et al. . The inferior colliculus: with 168 illustrations. , (2005).
- Goyer, D., et al. A novel class of inferior colliculus principal neurons labeled in vasoactive intestinal peptide-Cre mice. eLife. 8, e43770 (2019).
