Opdagelse af CsgD-regulatoriske mål i salmonella biofilm ved hjælp af kromatin Immunopræcipitation og High-gennemløb Sequencing (ChIP-SEQ)

Bakterielle biofilmer, strukturelle aggregater af celler indlejret i en egenproduceret matrix, er resistente over for udtørring, antibiotika, og vært immunresponser¹. Som sådan, de forårsager vedvarende og kroniske infektioner og præsenterer unikke udfordringer for forskere på grund af deres løsninger på overlevelse og transmission. Salmonella enterica blev typhimurium (S. Typhimurium) har fundet at etablere phenotypisk heterogene populationer af biofilm aggregater, der er resistente over for udtørring og antibiotika, og plankton celler, der udtrykker virulensfaktorer i ren kultur, når de udsættes for miljømæssig stress (28 °C, begrænsende næringsstoffer)². Disse to celletyper opstår på grund af bistabilt udtryk af Master biofilm regulator, CsgD³. Vi har en hypotese om, at dette kan være en satsning-afdækning strategi for salmonella, hvor planktoniske celler deltager i kortsigtede transmission og biofilm celler er i stand til at fortsætte på lang sigt i miljøet, indtil en mulighed for at inficere en ny vært opstår^2,4. Mange af de regulerende elementer, der styrer CSG operon udtryk er velkarakteriseret⁵. Bortset fra ADRA og CSG operon⁶er der dog kun få lovbestemte mål for csgd. Identificering af csgd-regulerings netværket vil hjælpe os til bedre at forstå salmonella livscyklussen og den rolle, som biofilm spiller i transmissionen.

Chromatin immunopræcipitation efterfulgt af høj gennemløb sekvensering (ChIP-SEQ) er en kraftfuld in vivo teknik til Genome-dækkende identifikation af protein-DNA-interaktioner og giver oplysninger om reguleringsprocesser, der involverer transkriptionsfaktorer, Histon modifikationer, eller nukleosomer⁷. Nyere undersøgelser har brugt denne teknik til at vurdere differentiale proteinbinding mellem vækstbetingelser og celletyper⁸. I kromatin immunopræcipitation (ChIP), DNA-fragmenter med interagerende proteiner er beriget gennem antistof udvælgelse af målproteiner. Celler høstes og DNA-bindende proteiner er tværbundet til DNA in vivo gennem formaldehyd Cross-linker behandling. Celler er lysed, frigive celleindholdet, og kromatin er klippet i ca 200 – 600 BP fragmenter⁷. DNA fragmenter bundet til målet protein er immunoprecipitated ved hjælp af antistof, og isoleret ved de-crosslinking efterfulgt af protein fordøjelse⁹. Disse DNA-fragmenter repræsenterer protein bindingssteder, der matches af hybridisering til et mikroarray (chip-chip) eller ved dyb sekvensering og kortlægning til genom-sekvensen^10,11. Selv om ChIP-chip eksperimenter giver passende lovgivningsmæssige data, er de begrænset på grund af brugen af dyre sonder, samt hybridisering og array bias¹². ChIP-SEQ har et større dynamisk område med øget nukleotidopløsning og dækning, forbedret signal-støj-forhold og færre artefakter i forhold til ChIP-chip⁷.

ChIP er blevet anvendt til at analysere SFH-og ompr-forordningen i salmonella blev typhimurium^13,14, quorum-sensing APHA forordning i Vibrio alginolyticus¹⁵, rpos forordning i Escherichia coli¹⁶, virulens regulator espr forordning i Mycobacterium tuberkulose¹⁷, potentielle diguanylatcyclaser gennem amrz forordning i Pseudomonas aeruginosa¹⁸, samt vrasr forordning i Staphylococcus aureus¹⁹. De bakterielle ChIP-SEQ eksperimenter, der er blevet beskrevet begynde med voksende celler i flydende medier og høst i enkelt celle form. Analysen af biofilmer og den tilsvarende gen-forordning udgør imidlertid et nyt sæt udfordringer, der skal føre til en vellykket ChIP-SEQ-protokol. I denne protokol anvendes ChIP-SEQ til at finde differentierede regulatoriske mål for CsgD, S. Typhimurium Master biofilm regulator i biofilm og plankton celletyper. Denne protokol beskriver de teknikker, der anvendes til at bestemme de relevante mængder af biofilm til spån-SEQ, høst biofilm fra kolbe kulturen, normalisere biofilm og enkelt celle kontrolprøver, homogeniserer biofilm og komplet immunopræcipitation. Dette vil være nyttigt til at studere de reguleringsmæssige mål i bakterielle biofilmer og kan tilpasses til mange arter.

1. vækst af kolbe kultur celle

1. Fra frosne bestande, streak salmonella blev typhimurium stammer på lb agar (20 ml solide medier i 100 mm Petri plade) med passende antibiotikum og inkuberes ved 37 °c for 16 – 20 h at opnå isolerede kolonier.
2. Inokulere 5 mL LB bouillon, der indeholder det relevante antibiotikum i et 25 mm x 150 mm borosilikat kulturrør med 1 – 3 kolonier fra stribe plader fra trin 1,1. Inkuber ved 37 °C med omrystning ved 200 rpm i 7 timer.
3. Mål OD₆₀₀ af bouillon kultur ved hjælp af et spektrofotometer. En alikvot af kultur 1 i 4 fortyndes i PBS i en 2 mL kuvette, og absorbansen måles ved 600 nm. Vi har fundet den mest kritiske faktor på dette trin for at være tidspunktet for vækst. OD-værdierne bruges til at normalisere kulturerne for at levere det ønskede antal celler i trin 1,4.
4. Tilsæt 1,0 OD₆₀₀ volumen ækvivalent af cellekultur (dvs. ~ 10⁹ celler) til en Erlenmeyer kolbe indeholdende 100 ml 1% trypton med det relevante antibiotikum. Inkuber ved 28 °C med omrystning ved 200 rpm i 13 timer.
   Bemærk: biofilm celler vises som aggregerede flager og enkelt planktoniske celler i det overskyede medie.

2. indsamling Cell-fri konditioneret 1% trypton

1. Saml kolbe kultur for celle-fri konditioneret 1% tryptone. Pipette kulturen flere gange for at blande den, før den tilsættes til et centrifugeglas.
2. Centrifugeres ved 12.000 x g i 10 minutter ved 10 °c for at pille alle celler.
3. Decant supernatanten ind i en 0,2 μm filterenhed, vakuum filter, og dispenserer i et nyt rør.
   Bemærk: biofilm aggregater er klæber i konventionelle opløsninger (f. eks PBS) og vil holde sig til siderne af rør og pipettespidser. Da det giver mulighed for lettere manipulation, bruger vi konditioneret medier (1% tryptone) til at flytte biofilm i første omgang og bruge varm PBS umiddelbart før Cross-Linking (trin 4,5) for at fjerne eventuelle proteinbinding substrater, der kunne være til stede i medierne.

3. adskillelse af biofilm og plankton celler fra kolbe kulturer²

1. Med en steril 25 mL pipette, alikvot kultur i 15 mL rør. Centrifugeres ved langsom hastighed (210 x g) i 2 min. for at adskille de to celletyper.
   Bemærk: biofilm celler bør danne en løs pille i bunden af røret
2. Den supernatanten, der indeholder plankton celler, afpipetteres i 2 40 mL centrifugeglas til senere (trin 5). Fjern al den resterende væske, og pas på ikke at forstyrre pellet. Gentag, indtil celle typerne er blevet adskilt fra alle kolbe dyrkningsmediet.

4. klargøring af biofilm aggregater

Bemærk: biofilm høstes ved våd vægt for at give 25 μg DNA, det anbefalede minimum udgangsmateriale til ChIP. Biofilm omregningsfaktor (BCF) af S. Typhimurium er 1,73 x 10⁸ CFU/mg². Forskere, der forbereder andre biofilm typer, skal empirisk definere antallet af celler pr. vægtenhed af biofilm, som bruges til at finde vægten af den biofilm, der kræves til 25 μg DNA-udgangsmateriale ved hjælp af denne ligning:

1. Afvejes en 2 mL snap cap eller skruelåg nøjagtigt.
2. Resuspendere biofilm pellet i 1 mL konditioneret tryptone. Flyt den opslæmmede biofilm til en forvejet 2 mL snap hætte eller skruelåg.
3. Centrifuge i 1 min ved 11 000 x g ved 20 °c
4. Fjern forsigtigt alle supernatanten fra røret og afvejes røret nøjagtigt. Træk rørets vægt fra rørenes vægt med biofilm for at finde vægten af biofilm. Den skal være ± 10% af vægten af målet biofilm.
5. Vask cellerne for at fjerne resterende konditioneret tryptone. Tilsæt 1 mL varm PBS til røret og vortex forsigtigt for at resuspendere pellet. Centrifuge i 3 min ved 8 000 x g til pellet biofilm og Fjern supernatanten. Tilsæt 1 mL PBS til røret og vortex for at resuspendere pellet.

5. klargøring af planktoniske celler

1. Optag volumen og OD₆₀₀ af plankton supernatanten fra langsom hastighed centrifugering (trin 3,2) ved hjælp af et spektrofotometer
2. Beregn den påkrævede mængde for en endelig OD₆₀₀ af 6,0:
   
3. Afkøl centrifugen til 10 °C og sediment planktoniske celler ved centrifugering (10.000 x g, 10 min ved 10 °c)
4. Supernatanten fjernes, og celle pellet opslæmmes i den endelige mængde PBS beregnet i trin 5,2.
5. Re-mål OD₆₀₀ af planktoniske celler ved hjælp af et spektrofotometer og dispensere mængden af 6,0 OD₆₀₀ planktoniske celler i en 2 ml snap cap eller skruehætte rør.
6. Tag volumen til 1 mL med PBS.

6. homogenisering af celler

1. Tilsæt en steriliseret 5 mm rustfrit stål perle til hver af rørene.
2. Homogeniser ved hjælp af en mixer Mill i 5 min ved 30 Hz. Overhold de samlede rør for at bekræfte, at biofilm er brudt fra hinanden.
3. Overføre de homogeniserede celler til en ny 1,5 mL rør, undgå metal perle. Bring volumenet til 1 mL med PBS.
   Bemærk: Udfør serielle fortyndinger for at optælle inputceller og kontrollere, at det endelige celle nummer er tæt på det ønskede eller forudsagte tal.

7. kryds sammenkædning af proteiner til DNA

1. Der dispenserer frisk formaldehyd i prøverørene til en slutkoncentration på 1%. Der inkubates i 30 min ved stuetemperatur på et roterende hjul.
   Forsigtig: formaldehyd er ætsende, hud, øje, og respiratorisk irritationsmoment, og brandfarlig. Dispensering i en stinkhætte.
2. Tilsæt 1 M Glycin til en endelig koncentration på 125 mM for at stoppe crosslinking. Der inkubates i 5 minutter ved stuetemperatur på et roterende hjul.

8. vaske celler til at fjerne overskydende Cross linker

1. Sediment cellerne ved 8.000 x g i 3 minutter og Fjern supernatanten
2. Resuspension af pellet i 20 μL 25x proteasehæmmere og 500 μL filter steriliseret PBS.
3. Centrifugeglasset i 3 min ved 8000 x g og Fjern supernatanten.

9. lyserende celler

1. Resuspension af pellet i 600 μL lyse buffer (Se tabel 1) og inkubere på is i 10 min.
2. Der tilsættes 1,4 mL IP-fortyndingsbuffer (Se tabel 1) til et sterilt 15 ml-rør, og der flyttes lyserede celler til 15 ml-røret. Hold røret på is i 1,5 – 2 timer, og vortex forsigtigt og lejlighedsvis.
   Bemærk: nogle resistente cellemateriale kan forblive i rør. En lang inkubationsperiode på is med lejlighedsvis vortexning vil bryde fra hinanden materiale. Resten vil blive brudt op gennem sonikering.

10. fragmentering af DNA ved sonikering

1. Anbring 15 mL-røret i et bægerglas, og Anbring 3 mm-sonden inde i røret.
2. Udfør 5 sonikering runder af 30 s på 20 – 40% af 400 W med 2 min køling på isen mellem brister.
3. Sediment fældet materiale ved centrifugering (8000 x g, 10 min ved 4 °c). Overfør supernatanten til et nyt rør.
4. Du skal eventuelt udføre decrosslinking ved 65 °C i 30 – 60 minutter og fordøje RNA og protein ved 45 °C i 30-60 min, før du kører på en 2% agopstået gel for at kontrollere, om der er passende størrelses fragmenter.
   Bemærk: Sænk sonden ind i celle lysatet. Opbevar opløsningen på is, mens du sonierer og hviler. Fjern ikke røret, mens sonikator sonden er pulserende. Opløsningen skal fremstå uklar præ-sonikering og klar post-sonikering.

11. immunoprecipiterende DNA-protein-antistof komplekser

1. Under forberedelse
   1. En 1,35 mL alikvot til immunopræcipitation og 1 200 μL alikvot som indgangskontrol dispenserer. Opbevar indgangs kontrollen ved-80 °C, indtil der udføres decrosslinking-og fordøje trin.
2. Immunopræcipitation med primært antistof
   1. Tilsæt 10 μg renset protein-specifikt primært antistof til 1,35 μL alikvot. Inkuber natten over ved 4 °C på et roterende hjul.
      Bemærk: det primære antistof kan være et monoklonalt antistof, et polyklonal serum af høj kvalitet eller et kommercielt epitop-antistof (dvs. anti-flag).
   2. Der tilsættes 50 μL protein G magnetiske perler til rørene fra trin 11.2.1 og inkuberes ved 4 °C i 3 timer på et roterende hjul.
   3. Placer IP-vaskebuffer 1, IP-vask buffer 2 og TE pH 8,0 (Se tabel 1) i en isspand. Varm elueringsbuffer til 65 °C.
      Bemærk: Anbring ikke opløsningen med elueringsbuffer på is.
   4. Bind proteinet G magnetiske perler til siden af rørene ved hjælp af en magnetisk stativ
   5. Udfør vaske: vask 2x med 750 μL kold IP-vask buffer 1, vask 1x med 750 μL kold IP-vask buffer 2, og vask 2x med 750 μL kold TE ved pH 8,0. Hold rørene på magnet stativet under skylningen.
   6. Tilsæt 450 μL IP-Elueringsbuffer (Se tabel 1) til hvert rør og inkuber ved 65 °c i 30 min med blid vortexning hver 5 min.
   7. Binde perler til siden af rør ved hjælp af en magnetisk stativ. Vent mindst 2 minutter, indtil opløsningen er klar.
   8. Den clearede supernatanten dispenserer til et nyt 1,5 mL rør, idet man er omhyggelig med ikke at forstyrre den magnetiske perle pellet.

12. decrosslinking DNA-protein komplekser og fordøje ende Co-rensning af RNA og protein

1. Der tilsættes 2 μg RNase A og NaCl til en endelig koncentration på 0,3 M til hvert rør.
2. Inkuber ved 65 °C, i ≥ 6 timer eller natten over.
3. Fuldfør protein fordøjelsen ved at tilsætte 180 μg proteinase K til hvert rør og inkuberet derefter ved 45 °C i 3 – 5 timer.

13. forberedelse og sekvensering af biblioteker

1. Rense DNA ved hjælp af magnetiske perler
   Bemærk: magnetiske perler foretrækkes til isolering af de små mængder DNA, der normalt opsamles under ChIP med bakterieceller.
2. Forbered biblioteker ved hjælp af et sæt, der er kompatibelt med den valgte sekvensering platform.
3. Kontrollér Biblioteks koncentrationen med et fluorometer og en bred vifte af dsDNA-sæt eller et qRT-PCR-Biblioteks kvantificerings kit.
   Bemærk: i vores erfaring kan fluorometer målinger overvurdere DNA-koncentrationen.
4. Pulje biblioteker, som tegner tilstrækkelig dækning for hver Biblioteks prøve. For Illumina sekventering med salmonella, vi poolede 10-12 biblioteker. Tilsæt Tris-HCl pH 8,0 til en slutkoncentration på 1 mM.
5. Rækkefølge efter den valgte platforms specifikationer.

Præparation af kromatin chromatinimmunpræcipitation prøver fra bakteriel biofilm involverer flere trin, som vist i figur 1. Disse omfatter dyrkning af biofilm i kolbens kultur, indsamling af konditionerede medier, indsamling af en passende mængde biofilm og planktoniske celler som kontrol, vaske celler i PBS, homogenisering, binding proteiner til DNA, lyserende celler, fragmentere DNA ved sonikering, immunoprecipitating DNA med passende antistoffer og protein G perler, vask og eluering immunoprecipitated DNA, og rense DNA til bibliotek forberedelse og sekvensering.

S. typhimurium celler dyrket i flydende kultur under biofilm-inducerende betingelser undergår fænotype Skift til dannelse af flercellede biofilm aggregater og planktoniske celler. Denne population vil indeholde ca. 40% biofilm aggregater, som udtrykker højere niveauer af diguanylatcyclaser (DGCS) og biofilm regulatorer, og 60% planktoniske celler, som udtrykker højere niveauer af virulens-associerede gener^2,4( figur 2A). I denne protokol beskriver vi en metode til høst af begge celletyper for at sammenligne transkriptionssteder gennem ChIP-SEQ; denne protokol kan dog tilpasses andre typer af biofilmer, der dannes af andre bakteriearter. Biofilm aggregater og plankton celler adskilles ved langsom hastighed centrifugering, som pellets biofilm og efterlader planktoniske celler i supernatanten² (figur 2B). Celle typerne behandles derefter separat for de efterfølgende trin i protokollen.

Den anbefalede mængde DNA-input til ChIP-SEQ er 10-25 μg²⁰. I S. Typhimurium kolbe kultur, 30 mg biofilm giver ca. 25 μg DNA. Da biofilm aggregater har en overflod af proteinholdige ekstrellulære materiale, vi hypotese, at dette ville forstyrre effektiviteten af Cross-Linking. Hvis vi simpelthen skulle normalisere de forskellige celletyper efter celle nummer, kan behandling af planktoniske celler resultere i en ulige mængde af tværbundet produkt præsenteret for immunopræcipitation. Der blev udført en proteinanalyse for at bestemme den tilsvarende mængde planktonisk cellemateriale til at matche 30 mg biofilm (figur 3). 6,0 OD₆₀₀ af planktoniske celler blev høstet for at matche 30 mg biofilm.

Biofilm aggregater skal først brydes fra hinanden for at give lige adgang til Cross-linker til alle celler. Vi fandt, at den mest ensartede og High-gennemløb måde at homogenisere cellerne var ved hjælp af en mixer mølle og 5 mm rustfrit stål perle (figur 4a). Plankton celler behandles på samme måde for at reducere variablerne i ChIP-SEQ-eksperimentet (figur 4B).

Når DNA er blevet fragmenteret ved sonikering, crosslinked, og behandlet med RNase og proteinase K, det kan visualiseres på en 2% agopstået gel. Soniseret DNA er opdelt i en samling af fragmenter, der vises som en smøre på agrose gel. Den gennemsnitlige fragment størrelse falder med et stigende antal sonikering brister (figur 5). Energioverførsel vil variere for forskellige sonicator enheder, så en sonikering analyse anbefales for at bestemme antallet af sonikering udbrud kræves for at fragmentere DNA til et gennemsnit på mindre end 1 kb. For vores ChIP-SEQ eksperiment valgte vi 5 brister.

Encode retningslinjer anbefale en bekræftelse af antistof Target-binding aktivitet med en immun²¹. I dette tilfælde målte vi vores antistof specificitet og styrke bindende ved immun på hele celle lysater forberedt til ChIP (figur 6). Vi bekræftede, at antistoffet binder sig til CsgD-3xFLAG; anti-FLAG og anti-CsgD signaler colocalize ved den forventede molekylvægt (28 kDa)²².

ChIP procedurer giver ofte lave koncentrationer af DNA. Derfor er en rensningsmetode, der fjerner forurenende stoffer og bevarer en stor del af DNA blev valgt. Magnetisk perle rensning blev valgt over kolonne-baseret rensning, fordi det beholdt lave koncentrationer af input ChIP DNA bedre (figur 7) og fjernede forurenende stoffer (data ikke vist).

På grund af reducerede start mængder af DNA kan Biblioteks klargøring af ChIP-DNA kræve fortyndede adaptere og PCR-berigelse. Inden sekvensering kan biblioteker visualiseres af Bioanalyzer Trace for at bekræfte korrekt størrelsesfordeling før og efter PCR-berigelse (figur 8). Hvis der er et kendt reguleringsmål for transkriptionsfaktoren, bør qPCR desuden anvendes til at bekræfte berigelse af bindings områder ved at sammenligne foldnings ændring (∆ ∆ CT) mellem kendt målsekvens og reference-gensekvenstæthed i immunopræcipiteret og soniseret indgangs DNA.

ChIP-sekvensering data bør analyseres ved at tildele kvalitet scores, trimning lav kvalitet baser, justering fremad og omvendte læser (i parret sekventering), montage til en høj kvalitet reference genom, finde toppe over baggrunden, og udfører downstream-analyse (figur 9a). Downstream-analyse bør omfatte visualisering og Annotation af toppe, konsistens med biologiske replikatprøver og Motif-analyse, og kan omfatte differentialbindings analyse mellem betingelser eller celletyper og dataintegration med genekspression fra kendte veje. For ChIP-SEQ-data som vores bør toppe identificeres som væsentligt over baggrunden (figur 9B, C, røde bjælker) med en p -værdi bestemmelse, ikke blot ved fold-Change. I den endelige analyse visualiseres de kortlagte læsninger mod anmærkningen af reference genomet (figur 9D). En dårlig ChIP-SEQ-resultat ville fremstå som input-SEQ uden nogen væsentlige toppe over baggrunden.

Figur 1: illustration af trin i spån-SEQ med bakterielle biofilmer. I den beskrevne procedure, S. Typhimurium celler dyrkes i 1% Tryptone kolbe kultur ved 28 °C med ryste (1), celle-fri konditionerede medier er indsamlet til håndtering af biofilm celletyper (2), som bruges til at indsamle en passende mængde af biofilm og planktoniske celler (3). Disse celler vaskes med PBS og homogeniseret til at bryde fra hinanden biofilm (4). Proteiner er tværbundet til DNA med en formaldehyd CROSSLINKER, hvorefter cellerne lyseres for at frigive cellens indhold (5). DNA i celle lysatet er fragmenteret ved sonikering (6). DNA-tværbundet til målproteinet udvælges gennem immunopræcipitation med et antistof, der binder sig til målproteinet og protein G magnetiske perler (7). Det valgte DNA vaskes og eluppes fra protein G magnetiske perler (8) og renses til Biblioteks klargøring og sekvensering (9). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 2: in vitro-kolbe model til studier af S. Typhimurium biofilm udvikling. (A) S. Typhimurium celler dyrket i 1% trypton for 13 h ved 28 °c undergår fænotype Skift til dannelse af biofilm aggregater og plankton celler i den flydende fase af kolbe kulturen. B) biofilm aggregater og plankton celler fra kolbens kulturen i (A) blev udskilt ved centrifugering ved 210 x g i 2 min. Supernatanten blev høstet for plankton celle præparater og pellet blev høstet for biofilm celle præparater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 3: totale proteinkoncentrationer for plankton celler og biofilm celleprøver høstet fra S. Typhimurium kolbe kultur. Der blev udført kolorimetriske proteinassays, og protein mængder i forhold til en BSA-standardkurve blev målt ved 750 nm. Protein indholdet i lyserede plankton celleprøver ved 4,0, 6,0 og 8,0 OD₆₀₀ blev sammenlignet med 30 mg biofilm aggregater. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4: homogenisering af celleprøver fra S. Typhimurium biofilm kolbe kulturer. A) biofilm aggregater fra kolbe kulturen resuspenderet i PBS (venstre) blev homogeniseret ved hjælp af en mixer mølle ved 30 Hz i 5 min (højre). B) planktoniske celler fra kolbe kulturen resuspenderet i PBS blev forarbejdet af mixer Mill ved 30 Hz i 5 min for at sikre konsistens mellem celletype prøverne. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 5: sonikering analyse med præ-ChIP celle lysates. Biofilm aggregat-og plankton celleprøver blev separeret, homogeniseret, tværbundet og lysed. DNA-protein komplekser blev soniseret op til 8 gange ved 30 s på og 2 min off på is for at bryde DNA i mindre fragmenter. En del af det sonislede lysat blev separeret på en 2% agopstået gel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 6: målbindende specificitet af anti-flag antistof, der anvendes i ChIP-SEQ. Antistof specificitet blev vurderet ved blot mod hele celle lysater fremstillet af kolbe kulturer af S. Typhimurium stammer som vist. Stamme ∆ csgD + p3xFLAG/csgd og WT biofilm prøver repræsenterer biofilm aggregater høstet fra kolber, mens stamme ∆csgd ± p3xFLAG og WT planktoniske celler repræsenterer planktoniske celler. Renset hans-Tagged CsgD blev indlæst som en kontrol. Hele celle lysater blev normaliseret, således at 30 μg total protein blev analyseret i hver vognbane. Tal til venstre refererer til størrelsen (i kDa) af de præfarvede molekylvægt markører. Primært antistof, der anvendes til øvre blot var kanin-anti-FLAG polyklonal antistof (Sigma-Aldrich #F7425), mens den nedre skamplet blev inkuberet med kanin-anti-FLAG sammen med et CsgD-specifikt monoklonalt antistof². Ged anti-kanin IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) og ged anti-mus IgG (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) blev brugt som sekundære antistoffer. Fluorescerende signaler blev visualiseret ved hjælp af Odyssey CLx Imaging System og Image Studio 4,0 softwarepakke (Li-cor Biosciences). Repræsentative billeder vises. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 7: kolonne-eller magnetiske perle baserede rensnings strategier for små mængder DNA som følge af spån-SEQ-eksperimenter. Prøver af kendte mængder DNA blev renset ved hjælp af kolonnebaserede kits eller magnetiske perler, og koncentrationen af eluatet blev målt efter rensning. Magnetiske perler viste bedre bedring ved lave DNA-niveauer, svarende til de lave mængder af DNA typisk stødt på i slutningen af ChIP-SEQ-protokollen, men forud for NGS bibliotek forberedelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 8: ChIP-DNA-præparater og efterfølgende biblioteker visualiseret af Bioanalyzer. (A) gennemsnitlig fragment størrelse af GENOMISK DNA efter cellelyse og sonikering var < 1000 BP, med et flertal af fragmenter i 200 – 500 BP-området. (B) udgangsmateriale til Biblioteks forberedelse var under detektion. C) adapter ligering og PCR-berigelse giver mulighed for forstærkning af Biblioteks fragmenter. (D) et dårligt bibliotek præparat har lav DNA toppe, ulige formede eller høj molekylvægt toppe, eller rigelige adapter toppe på ca. 100 BP. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 9: ChIP-SEQ data analyseres ved hjælp af bioinformatiske værktøjer og visualiseret på en genom browser. A. rutediagram for typisk bioinformatisk analyse af ChIP-SEQ-data. RAW-læsninger for biofilm (∆csgd Strain + P3xFLAG/csgd) og planktoniske celler (∆csgd + p3xFLAG) blev renset for læse-og adaptere af lav kvalitet og kortlagt til S. Typhimurium 14028s genomer (NC_016856. f. for kromosom og NC_016855...) af Bowtie2 (v 2.3.3.1) med standardparametre²³. MACS2 (v 2.1.2) blev brugt til at kalde toppene med parametre af '-q 0,01--nomodel ', idet biofilm replikater som test datasæt og plankton som kontrol²⁴. MACS2 bdgcmp-modulet blev yderligere brugt til at generere fold-berigende spor med parametre for '-m FE '. Den betydelige peak fil med fold-berigelse spor blev omdannet til en paryk fil ved hjælp af bedtools/bedClip/bedGraphToBigWig²⁵ og visualiseret på reference genom ved hjælp Integrative Genomics Viewer v 2.5.1²⁶. Repræsentative toppe vises (røde bjælker). (B) stor region på ~ 40 KBP, som indeholder flere toppe, er et atypisk resultat, men stadig potentielt værdifuldt. (C) Dette er et mere typisk resultat, der viser to væsentlige spids regioner. (D) Zoom ind på venstre spids i C, viser læser kortlægning til regionen af S. Typhimurium 14028s genom, der indeholder divergerende promotorer for uSpA og uspb. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Tabel 1. Buffer opskrifter.

Denne protokol skitserer en teknik til at udføre ChIP-SEQ med salmonella enterica blev typhimurium biofilm og planktoniske celler fra ren kultur, at finde reguleringsmæssige mål for Master biofilm regulator, csgd. Vi forventer differens binding oplysninger på grund af den bi-stabilitet af csgd i de to celletyper, med høje niveauer i biofilm aggregater og lave niveauer i planktoniske celler^2,3. Men, denne teknik kan også anvendes til andre bakterielle transkriptionsfaktorer, celletyper, eller vækstbetingelser. Denne teknik kan især tilpasses andre bakterielle biofilmer ved hjælp af en eksperimentelt bestemt omregningsfaktor for CFU pr. vægtenhed af biofilm celler.

ChIP-SEQ kan være tilbøjelige til at forstærke tekniske fejl gennem sekvensering; Men, bekræftelse på kritiske trin kan forhindre denne²⁷. Primær antistof specificitet er vigtig for kun at udvælge måltranskriptionsfaktoren og den DNA, den kontrollerer under immunopræcipitation⁷. I dette eksperiment blev csgd smeltet til et plasmid-kodet 3xFLAG-tag ved den 3 ' ende af genet, svarende til C-endestation af csgd²². P3xFLAG plasmid uden csgD blev anvendt som en "kontrol" (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). Encode retningslinjer anbefaler at udføre immunoblots med primære antistof mod det protein af interesse, og lysater af ChIP stammer og sletning stammer²¹. Det er vigtigt at sikre, at vækstbetingelserne er konsistente på tværs af replikater for at reducere variabiliteten i transkriptionsfaktor binding og downstream-sekvensering af resultater. Hvis man er omhyggelig med at sikre, at inokulum størrelser og præ-inokulum vækstbetingelser er konsistente, er biofilm vækst i kolbe kulturen konsistent⁴. Det er vigtigt at bekræfte, at alle biofilm er brudt ud efter homogenisering, for at sikre lige adgang for reagenser, især formaldehyd Cross-linker, til alle celler.

Flere modifikationer kan gøre det muligt for forskerne at bruge denne protokol til andre DNA-bindende proteiner, celletyper, stammer, vækstbetingelser eller laboratorieudstyr. Anvendes til andre biofilm-dannende arter end S. Typhimurium, omregningsfaktoren for kolonidannende enheder pr. enhed vægt af biofilm skal bestemmes eksperimentelt ved høst forskellige mængder af biofilm, homogenisering af biofilm grundigt, og udfører serielle fortyndinger og plade tælling at skabe en standardkurve, som ikke kan være nøjagtige ved lavere biofilm vægte². Sonicator energioverførsel og celletype resistens kan afvige; Derfor anbefales en sonikering analyse for at finde antallet af sonikering brister, der vil producere det fragment størrelsesinterval, der kræves til downstream-bibliotekets forberedelse og sekvensering¹¹. Kromatin fragmentering af micrococcal nuclease er et alternativ til sonikering, der producerer høj opløsning af belægnings steder; Men, denne metode kan indføre fragmentering bias^7,28. DNA-størrelsesintervallet kan ændres afhængigt af downstream-bibliotekets forberedelses kits og sekventering platforme. Andre metoder til homogenisering kan anvendes i stedet for Blanderen mølle. For eksempel kan en glasvæv homogenisator erstattes, men det kan aerosolize eller ufuldstændigt nedbryde biofilm. Med hensyn til kontrol, præ-immunoprecipitate DNA kan normaliseres i post-Sequencing behandling og analyse. En mock-IP kontrol med Arts-matchede normale antistof serum kan bruges som en kontrol samt¹³.

Forskerne skal overveje begrænsningerne i denne metode, når de betragter et ChIP-SEQ-eksperiment. Det kan være nødvendigt at foretage væsentlige ændringer for at tilpasse det til andre biofilm-typer. For eksempel, med salmonella typhimurium øjeblikkelig opblanding af biofilm i PBS fører til målbare tab af biofilm aggregater. Immunopræcipitation rettet mod regulatoriske mål for transkriptionsfaktorer i bakterier kan resultere i meget små mængder af DNA, hvilket er en udfordring for rensning og detektion på senere trin. Bias kan indføres under klipning og nedstrøms manipulation under biblioteks detektering⁹. Desuden afslører denne metode ikke in vivo-ekspressionsniveauer som reaktion på transkriptionsfaktor binding. Forskere, der har ringe erfaring inden for Bioinformatik, kan blive udfordret af analyse rørledningen. Denne metode kan være tidskrævende og dyr; men omkostningerne ved sekvensering er ofte lavere end et mikroarray og er faldende over tid, da teknologiske forbedringer fortsat gøres.

Få metoder i litteraturen beskrive ChIP med bakterier, og de fleste bakterielle eksperimenter begynder med en simpel vækst betingelse^{13,14,15,17,18}. Spån prøveforberedelse med enkeltceller er ligetil og præsenterer færre udfordringer end spån prøveforberedelse med biofilm aggregater. Hvad angår ChIP-SEQ, er tidligere metoder til undersøgelse af CIS-regulatoriske kredsløb, herunder systematisk udvikling af ligander ved eksponentiel berigelse (SELEX), elektroforetiske mobilitets Skift assays (EMSA), chip-chip, promotor-sletning og reporter-analyse blevet suppleret eller erstattet af chip-SEQ²⁹. ChIP-SEQ erstatter ChIP-chip på grund af fremme af teknologier og tilgængelighed af sekvensering. Deep sekvensering giver forskerne massive mængder data, der kan identificere websites med lavere bindingsaffinitet og højere base pair opløsning med mindre udgangsmateriale end chip-chip^11,30. Analyse af ChIP data fra organismer med reference genomer af høj kvalitet er generelt hurtig og specifik. Desuden er ChIP-SEQ en grundig metode til at opdage i silico forudsagte bindingssteder, der måske ikke er besat i alle celletyper, vækstfase, eller miljømæssige forhold³¹.

I fremtiden kan denne protokol bruges til at lette forståelsen af bakteriel patogenese, især biofilm-dannende organismer. Bred anvendelse af denne teknik og tilgængeligheden af nye datasæt kan føre til dataintegration for at identificere grupper af proteiner, der samlokaliserer for at kontrollere cellulære processer i biofilm-dannende mikroorganismer³². Desuden kan data fra ChIP-SEQ og RNA-SEQ integreres for at opbygge reguleringssystem modeller³³.