JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genética

גילוי מטרות רגולטוריות של CsgD באמצעות כרומטין Immunoprecipitation ורצף של תפוקה גבוהה (שבב-seq)

Published: January 18, 2020
doi:
10.3791/60736
, ,
1Vaccine and Infectious Disease Organization-International Vaccine Centre, 2Department of Biochemistry, Microbiology and Immunology,University of Saskatchewan, 3Department of Cell Biology and Genetics,Shenzhen University Health Science Center

Summary

כרומטין immunoprecipitation בשילוב עם רצף הדור הבא (שבב-seq) היא שיטה המשמשת ליצירת אינטראקציות בין גורמי שעתוק ואת רצפי גנומי הם שולטים. פרוטוקול זה מתאר טכניקות עבור ביצוע שבב-seq עם ביומאמים חיידקיים, באמצעות סלמונלה בידור החיידק Typhimurium בקטריות כדוגמה.

Abstract

כרומטין immunoprecipitation ואחריו ברצף (שבב-seq) היא טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לגלות את המטרות הרגולטוריות של גורמי שעתוק, שינויים היסטון, ו-DNA אחרים הקשורים חלבונים. נתוני שבב-seq יכולים לשמש גם כדי למצוא כריכה דיפרנציאלית של שעתוק גורמים בתנאים סביבתיים שונים או סוגי תאים. בתחילה, שבב בוצע באמצעות היברידיזציה על מיקרוarray (שבב צ’יפ); עם זאת, שבב-seq הפך את השיטה המועדפת באמצעות פיתוחים טכנולוגיים, הפחתת מחסומים פיננסיים לרצף, וכמויות מסיבית של פלט נתונים באיכות גבוהה. טכניקות של ביצוע שבב-seq עם ביויואמים חיידקיים, מקור מרכזי של זיהומים מתמידים וכרוניים, מתוארים בפרוטוקול זה. שבב-seq מבוצע על סלמונלה בידור serovar ביוהיריום ותאי פלנקטון, מיקוד הרגולטור הראשי ביוilm, csgd, כדי לקבוע את הכריכה הדיפרנציאלית בשני סוגי התא. כאן, אנו מדגימים את הכמות המתאימה של הביו-היקף לקציר, נורמליזציה למדגם בקרת פלנקטון, הומוגניזציה עבור גישה חוצת-מקשר, וביצוע צעדים שגרתיים של שבב-seq כדי להשיג תוצאות באיכות גבוהה ברצף.

Introduction

ביואמים חיידקיים, אגרגטים מבניים של תאים המוטבעים במטריצה מיוצרת עצמית, עמידים בפני התייבשות, אנטיביוטיקה ותגובות החיסון המארחות1. ככאלה, הם גורמים לזיהומים מתמידים וכרוניים ומציגים אתגרים ייחודיים לחוקרים בשל הפתרונות שלהם להישרדות ושידור. סלמונלה בידור שירומויום (S. Typhimurium) נמצא להקים אוכלוסיות הטרוגנית בדרך כלל של אגרגטים ביוארגור העמידים בפני התייבשות ואנטיביוטיקה, ותאי פלנקטון אשר מבטאים גורמים התקפה אלימה בתרבות טהורה כאשר נחשפים לחץ סביבתי (28 ° צ’, הגבלת חומרים מזינים)2. שני סוגי תאים אלה נובעים בשל ביטוי bistable של הרגולטור הראשי של הביוilm, CsgD3. יש לנו שיערו כי זה יכול להיות אסטרטגיה מגידור ההימור עבור סלמונלה, כאשר התאים פלנקטון להשתתף שידור לטווח קצר ותאי ביוilm מסוגלים להתמיד לטווח ארוך בסביבה עד הזדמנות להדביק מארח חדש נובע2,4. רבים מרכיבי הרגולציה השולטים בביטוי csg אופרון מאופיינים היטב5. עם זאת, מלבד adra ו csg אופרון6, מטרות רגולטוריות מעטים של csg ידועים. זיהוי הרשת התקינה CsgD יעזור לנו להבין טוב יותר את מחזור החיים של סלמונלה ואת התפקיד כי ביוילאמים לשחק בשידור.

כרומטין immunoprecipitation ואחריו ברצף התפוקה הגבוהה (שבב-seq) היא חזקה בטכניקה vivo עבור זיהוי הגנום-כולל של אינטראקציות חלבון-DNA ומספק מידע על תהליכים הרגולציה מעורבים גורמי שעתוק, שינויים היסטון, או נוקלאוטיזומים7. מחקרים חדשים יותר השתמשו בטכניקה זו כדי להעריך את כריכת החלבון הדיפרנציאלי בין תנאי גדילה וסוגי תאים8. ב כרומטין immunoprecipitation (שבב), שברי דנ א עם חלבונים אינטראקציה מועשר באמצעות נוגדנים מבחר של חלבונים היעד. תאים הם קוצרים ו-DNA מחייב חלבונים הם מקושרים ל-DNA ב vivo דרך פורמלדהיד חוצה מקשר הטיפול. תאים הם מוקפצים, שחרור תוכן התאים, ו כרומטין הוא השזרמו כ 200 – 600 שברי bp7. שברי דנ א כרוך חלבון היעד הם immunoprecipitated באמצעות נוגדן, ומבודד על ידי דה-crosslinking קישור ואחריו עיכול החלבון9. שברי ה-DNA הללו מייצגים אתרי כריכת חלבון בהתאמה הכלאה למיקרומערך (שבב שבב) או על ידי רצף עמוק ומיפוי לרצף הגנום10,11. למרות הניסויים שבב צ’יפ להניב נתונים רגולציה נאותה, הם מוגבלים בשל השימוש בבדיקות יקרות, כמו גם היברידיזציה הטיה מערך12. שבב-seq יש טווח דינמי גדול יותר עם רזולוציה מוגברת נוקלאוטיד וכיסוי, יחס אות לרעש משופר, ופחות פריטים בהשוואה שבב שבב7.

שבב שימש לניתוח ה-sfh ו-ompr ב סלמונלה serovar typhimurium13,14, ויסות החישה של apha ב- vibrio alginolyפטיקוס15, תקנה rpos בתוך eschia coli16, התקפה אלימה הרגולטור ברגולציה ב- פטרת השחפתdiguanylate, פוטנציאל של בקרת amrz באמצעות התקנה של הפסאודומונס aeruginosa18, כמוגם vrasr . בסדר. הניסויים החיידקיים שבב-seq שתוארו להתחיל עם הגדלת תאים במדיה נוזלי וקצירת בצורת תא בודד. עם זאת, ניתוח של ביואילאמים ותקנות הגנים המתאימים מייצג קבוצה חדשה של אתגרים כדי ליצור פרוטוקול שבב-seq מוצלח. בפרוטוקול זה, שבב-seq משמש כדי למצוא מטרות הרגולציה הדיפרנציאלי של CsgD, S. הרגולטור הראשי של היומוופריום. בתוך ביוilm ובסוגי תאי הפלאנטוניק פרוטוקול זה מתאר טכניקות המשמשות כדי לקבוע את הכמויות המתאימות של הביו-משתמשים עבור שבב-seq, ביוכי הקציר מתרבות הבקבוקון, לנרמל את השימוש בדגימות ובקרת תאים בודדים, המגון ביוilm והשלמת immunoprecipitation. זה יהיה שימושי עבור לימוד מטרות הרגולציה של ביויואמים חיידקיים ניתן להתאים עבור מינים רבים.

Protocol

1. בקבוקון צמיחת תאים של התרבות ממניות קפואות, רצף סלמונלה serovar Typhimurium זנים על LB אגר (20 מ”ל מדיה מוצק 100 mm לוחית פטרי) עם אנטיביוטיקה המתאים דגירה ב 37 ° צ’ עבור 16 – 20 h כדי להשיג מושבות מבודדות. מחסן ליברות 5 מ ל המכיל את האנטיביוטיקה המתאימה ב 25 מ”מ x 150 מ”מ בורוסיליקט התרבות שפופרת עם 1 – 3 מושבות מלוחות פס משלב 1.1. מודטה ב 37 ° c עם טלטול ב 200 סל ד עבור 7 h. מדידת OD600 של תרבות ציר באמצעות ספקטרוסקופיה. לדלל את התרבות 1 ב-PBS ב קובט 2 mL ולמדוד את ספיגת ב 600 nm. מצאנו את הגורם הקריטי ביותר בשלב זה כדי להיות זמן הצמיחה. ערכי ה-OD משמשים לנרמול התרבויות כדי לספק את מספר התאים המבוקש בשלב 1.4. הוסף 1.0 OD600 נפח המקבילה של תרבות התא (כלומר ~ 109 תאים) לבקבוקון erlenmeyer המכיל 100 mL של 1% טריטונים עם אנטיביוטיקה המתאים. דגירה ב 28 ° צ’ עם טלטול ב 200 סל ד עבור 13 h.הערה: התאים הביותוניים יופיעו כפתיתים צבורים ותאי פלנקטון בודדים נמצאים במדיה המטרים. 2. איסוף ממוזג ללא מזגן 1% טריטונים לאסוף תרבות בקבוקון עבור תא ממוזג 1% טריטונים. פיפטה בקבוקון תרבות מספר פעמים כדי לערבב לפני הוספת צינור צנטריפוגה. צנטריפוגה ב 12,000 x g עבור 10 דקות ב 10 ° c כדי גלולה כל התאים. Decant סופר לתוך יחידת מסנן 0.2 יקרומטר, מסנן ואקום, ומדלג לתוך צינור חדש.הערה: האגרגטים של ביוilm מיוענים בפתרונות קונבנציונליים (כגון PBS) והיא תיצמד לדפנות הצינורות ולעצות הפיפטה. כיוון שהיא מאפשרת מניפולציה קלה יותר, אנו משתמשים באמצעי תקשורת ממוזגים (1% טריטונים) כדי להעביר בתחילה את הביוilm ולהשתמש ב-PBS חם מיד לפני הקישור החוצה (שלב 4.5) כדי להסיר את כל החלבונים המקשרים מצעים שיכול להיות נוכח במדיה. 3. הפרדת התאים הבין-ביותוניים לבין תרביות בקבוקון2 באמצעות פיפטה סטרילי של 25 מ ל, בקבוקון תרבות לצינורות של 15 מ ל. צנטריפוגה במהירות איטית (210 x g) עבור 2 דקות, כדי להפריד בין שני סוגי התא.הערה: התאים הביויומים צריכים ליצור גלולה רופפת בתחתית הצינור פיפטה את הסופרנטנט המכיל תאים פלנקטון לתוך 2 40 mL לצינורות צנטריפוגה למועד מאוחר יותר (שלב 5). להסיר את כל הנוזלים הנותרים, להיזהר לא להפריע את הגלולה. חזור על הפעולה עד שסוגי התאים הופרדו מכל המדיה התרבותית של הבקבוקון. 4. הכנת אגרגטים ביוilm הערה: ביוilm נקצרו על ידי משקל רטוב כדי להניב 25 μg של דנ א, החומר ההתחלתי המינימלי המומלץ עבור שבב. פקטור המרת ביוilm (BCF) של S. Typhimurium היא 1.73 x 108 cfu/mg2. חוקרים הכנת סוגי ביוסוגים אחרים יצטרכו להגדיר מדעית את מספר התאים לכל משקל יחידה של ביוilm, אשר משמש כדי למצוא את המשקל של ביוilm נדרש עבור 25 μg של חומר התחלת ה-DNA באמצעות משוואה זו: שוקלים כובע הצמדה של 2 מ”ל או לברגים במדויק. השהה מחדש את הגלולה ב-1 מ ל של טריטונים ממוזגים. הזז את היישום המושהה מחדש לתוך כובע הצמדה מראש של 2 מ”ל או כובע בורג. צנטריפוגה עבור 1 דקות ב 11 000 x g ב -20 ° c הסירו בזהירות את כל הסופרנטאנט מהצינור ושוקלים את הצינורית במדויק. הפחת את משקל הצינורית מעובי הצינורית באמצעות ביוilm כדי למצוא את המשקל של ביוilm. זה אמור להיות ± 10%. ממשקל הביו, המטרה שטוף תאים כדי להסיר את הטריטונים הממוזגים הנותרים. הוסף 1 מ ל של PBS חם לצינור מערבולת בעדינות כדי להשעות את הגלולה מחדש. צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 8 000 x g כדי ביוilm גלולה ולהסיר את הסופרנטאנט. הוסף 1 מ ל של PBS לצינור ומערבולת כדי להשעות מחדש את הגלולה. 5. הכנת תאי פלאנטוניק הקלטת את עוצמת הקול ואת ה-OD600 של מהירות המטוס מצנטריפוגה (שלב 3.2) באמצעות ספקטרוסקופיה חשב את אמצעי האחסון הדרוש עבור OD הסופי600 של 6.0: מגניב את הצנטריפוגה ל 10 מעלות צלזיוס ותאי פלנקטון משקעים על ידי צנטריפוגה (10,000 x g, 10 דקות ב -10 ° c) הסר את הסופרנטאנט והשהה מחדש את הגלולה בנפח הסופי של PBS המחושבת בשלב 5.2. למדוד מחדש OD600 של תאים פלנקטון באמצעות ספקטרוסקופיה ולוותר על נפח של 6.0 OD600 התאים פלנקטון לתוך כובע הצמד mL או שפופרת בורג כובע. הביאו נפח ל-1 מ ל עם PBS. 6. הומוגניזציה של תאים הוסף אחד מעוקר 5 מילימטר מפלדת אל-חלד לכל הצינורות. הומוגון באמצעות טחנת מערבל עבור 5 דקות ב-30 Hz. שימו לב לצינורות מצטברים כדי לוודא כי ביוilm התפרק. להעביר את התאים המהומוגניים לצינור חדש 1.5 mL, הימנעות חרוז מתכת. הביאי את הכרך ל-1 מ ל עם ה-PBS.הערה: בצע דילול טורי כדי לספור תאי קלט ובדוק שמספר התאים הסופי קרוב למספר הרצוי או החזוי. 7. קישור צולב של חלבונים ל-DNA מוותר פורמלדהיד טרי לתוך שפופרות לדוגמה הריכוז הסופי של 1%. דגירה של 30 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב.זהירות: פורמלדהיד הוא מאכל, עור, עין, מטרד הנשימה, דליק. . מוותר על מכסה המנוע הוסף 1 מ גליצין לריכוז הסופי של 125 מ”מ כדי להפסיק את הקישור. דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר על גלגל מסתובב. 8. שטיפת תאים כדי להסיר הצלב העודף משקע את התאים ב 8,000 x g עבור 3 דקות ולהסיר את הסופרנטנט השהה מחדש את הגלולה ב 20 μL של מעכבי הפרוטאז 25x ו-500 μL של מסנן מעוקר PBS. שפופרת צנטריפוגה עבור 3 דקות ב 8000 x g ולהסיר את supernatant. 9. לישיר תאים השהה מחדש את הגלולה ב-600 μL הליזה מאגר (להתייחס לטבלה 1) ו-דגירה על הקרח 10 דקות. הוסף 1.4 mL של מאגר דילול ה-IP (עיין בטבלה 1) לצינור שפופרת סטרילי במשך 15 מ”ל והעבר תאים למטה לצינור 15 מ”ל. שמרו את השפופרת על הקרח במשך 1.5 – 2 h, ומערבולת בעדינות ולעיתים.הערה: חלק מהחומר העמיד בתאים עשוי להישאר בצינורות. תקופת הדגירה הארוכה על הקרח והוא מזדמן לפרק את החומר. . השארית תהיה מקולקלת דרך sonication 10. הגדלת ה-DNA על ידי sonication מניחים את הצינור 15 מ ל בגביע של קרח ומניחים את המקדח 3 מ”מ בתוך הצינור. לבצע 5 סיבובים sonication של 30 s ב 20-40% של 400 W עם 2 דקות קירור על הקרח בין התפרצויות. חומר זירז משקעים על ידי צנטריפוגה (8000 x g, 10 דקות ב -4 ° c). . העבר את הסופרנאנט לשפופרת חדשה באופן אופציונלי, לבצע קישור decrosslinking 65 ° c עבור 30 – 60 דקות לעכל RNA ו חלבון ב 45 ° צ’ עבור 30-60 דקות לפני הפעלת על 2% agarose ג’ל כדי לבדוק שברי גודל המתאים.הערה: לטבול את המקדח לתוך הליפוסט התא. שמרו על הפתרון בקרח בזמן שsonicating ונחים. אין להסיר את הצינור בזמן שsonicator בדיקה פועם. הפתרון צריך להופיע מעונן pre-sonication וברור post-sonication. 11. מכלולי Immunoprecipitating DNA-חלבון-נוגדן כנה מוותר על אחד 1.35 mL לimmunoprecipitation ו 1 200 μL הנורית כבקרת קלט. אחסן את בקרת הקלט ב–80 ° צ’ עד לביצוע שלבי הקישור והעיכול של decrosslinking Immunoprecipitation עם נוגדן ראשוני הוסף 10 μg של נוגדן העיקרי חלבון מטוהרים ל1.35 μL aliquot. המשך הלילה ב -4 ° c על גלגל מסתובב.הערה: הנוגדן העיקרי יכול להיות נוגדן חד-שבטיים, סרום רב-שבטיים באיכות גבוהה או נוגדן מסחרי (כלומר, אנטי דגל). הוסף 50 μL של חרוזי חלבון G מגנטי לצינורות משלב 11.2.1 ו-דגירה ב 4 ° צ’ עבור 3 h על גלגל מסתובב. המקום מאגר שטיפת IP 1, מאגר לשטוף IP 2, ו-TE pH 8.0 (להתייחס לטבלה 1) בדלי קרח. מאגר הימנעות חם עד 65 ° c.הערה: אין לשים פתרון המכיל מאגר הימנעות על קרח. אגד את חרוזי חלבון G מגנטי לצד צינורות באמצעות עמדה מגנטית לבצע שוטף: לשטוף 2x עם 750 μL קר מאגר שטיפת IP 1, לשטוף 1x עם 750 μL קר מאגר שטיפת IP 2, ולשטוף 2x עם 750 μL קר TE ב-pH 8.0. שמרו את הצינורות על המעמד המגנטי במהלך שטיפת. הוסף 450 μL של מאגר הימנעות IP (להפנות לטבלה 1) על כל צינור ו-דגירה ב 65 ° צ’ עבור 30 דקות עם הורטקנג עדין כל 5 דקות. אגד חרוזים לצד צינורות באמצעות מעמד מגנטי. המתן 2 דקות לפחות עד שהפתרון יהיה ברור. לוותר על סופר מנוקה לצינור חדש 1.5 mL, להיות זהיר לא להפריע את הגלולה חרוז מגנטי. 12. מכלולי מערכות DNA-חלבונים ועיכול שיתוף-רנ א וחלבון הוסף 2 μg RNase A ו-המשך הריכוז הסופי של 0.3 מ ‘ לכל צינור. דגירה ב 65 ° c, עבור ≥ 6 h, או לילה. השלמת עיכול החלבון על ידי הוספת 180 μg פרוטטינואז K לכל צינור, ואז הדגירה ב 45 ° צ’ עבור 3 – 5 h. 13. הכנה לספריות ולעריכת רצף טיהור דנ א באמצעות חרוזים מגנטייםהערה: חרוזים מגנטיים הם העדיפו לבידוד כמויות קטנות של DNA התאושש בדרך כלל במהלך שבב עם תאים חיידקיים. הכן ספריות באמצעות ערכה התואמת לפלטפורמת הרצף הנבחרת. בדוק ריכוז של הספרייה עם פלואורומטר ומגוון רחב dsDNA ערכת או ערכת הקוונפיקציה של הספריה-PCR.הערה: בניסיון שלנו, מדידות פלואורומטר עשויים להיות מיותר בריכוז DNA. ספריות בריכות, חשבונאות עבור כיסוי הולם עבור כל מדגם ספריה. לרצף הארה עם סלמונלה, היינו במאגר של 10 – 12 ספריות. הוסף טריס-HCl pH 8.0 לריכוז הסופי של 1 מ”מ. רצף לפי מפרט הפלטפורמה שנבחרה.

Representative Results

הכנת דגימות immunoprecipitation של כרומטין מתוך בקטריות בקטריאלי מערבת מספר שלבים, כפי שמוצג באיור 1. אלה כוללים ביוilm גדל בתרבות הבקבוקון, איסוף מדיה ממוזג, איסוף כמות נאותה של ביוilm ותאי פלנקטון כשליטה, תאי כביסה ב-PBS, המגון, המתקשרות חלבונים ל-dna, תאים lysing, מחרוזת ה-dna על ידי sonication, immunoprecipitating dna עם נוגדנים מתאימים וחלבון G חרוזים, כביסה ו משחררי immunoprecipitated dna, וטיהור dna עבור הכנת התאים של S. typhimurium גדל בתרבות הנוזלית תחת התנאים הגורם לשימוש באמצעות ביוilm לעבור פנוטיפ מיתוג כדי ליצור מנות של מצרפים של ביויולים ותאי פלנקטון. אוכלוסיה זו תכיל כ-40% מהאגרגטים של היחידה, אשר מבטאים רמות גבוהות יותר של diguanylate cyclases (dgcs) והרגולטורים של ביוטבוני, ו-60% תאים פלנקטון, אשר מבטאים רמות גבוהות יותר של גנים הקשורים למתקפה אלימה2,4 (איור 2א). בפרוטוקול זה, אנו מתארים שיטה לקצור את שני סוגי התא כדי להשוות את אתרי התמלול באמצעות שבב-seq; עם זאת, פרוטוקול זה יכול להיות מותאם עבור סוגים אחרים של ביואילאמים שנוצרו על ידי זנים חיידקיים אחרים. אגרגטים של ביוilm ותאי פלנקטון מופרדים באמצעות מהירות איטית צנטריפוגה, אשר כדוריות הביוגים ומשאיר תאים פלנקטון ב-supernatant2 (איור 2ב’). לאחר מכן, סוגי התאים מטופלים בנפרד עבור השלבים הבאים בפרוטוקול. הכמות המומלצת של קלט DNA עבור שבב-seq הוא 10-25 μg20. . ב. ס בקבוקון התרבות, 30 מ ג של ביוilm תשואות כ 25 μg DNA. מאחר שלאגרגטים של ביונוilm יש שפע של חומר מחקר, אנו שיערו שדבר זה יפריע ליעילות הקישור החוצה. אם היינו פשוט לנרמל את סוגי התא השונים על ידי מספר התא, הטיפול של תאים פלנקטון עלול לגרום כמות שוויונית של מוצר מקושר הציג עבור immunoprecipitation. שיטת החלבון בוצעה כדי לקבוע את הכמות המקבילה של חומר תא פלנקטון כדי להתאים 30 מ”ג של ביוilm (איור 3). 6.0 OD600 של תאים פלנקטון נקצרו כדי להתאים 30 מ”ג ביוilm. יש להפריד בין האגרגטים של ביוilm כדי לאפשר גישה שווה למקשר בין כל התאים. מצאנו כי הדרך האחידה ביותר התפוקה גבוהה כדי הומופורם את התאים היה באמצעות טחנת מערבל ו 5 מ”מ מפלדת אל חלד (איור 4א). תאים planktonic מטופלים באותה דרך כדי להפחית את המשתנים בניסוי שבב-seq (איור 4ב). לאחר ה-DNA כבר מפוצל על ידי sonication, crosslinked, וטיפל עם RNase ו פרוטאינאז K, זה יכול להיות מדמיין על 2% agarose ג’ל. DNA Sonicated הוא שבור לתוך אוסף של שברים המופיעים ככתם על ג’ל agarose. גודל השבר הממוצע פוחת עם מספר גדל והולך של התפרצויות sonication (איור 5). העברת אנרגיה תשתנה עבור יחידות sonicator שונות, כך שsonication מומלץ לקבוע את מספר ההתפרצויות הsonication הנדרשות ל-DNA מרסיס לממוצע של פחות מ-1 kb. , בשביל ניסוי השבב-seq שלנו. בחרנו 5 התפרצויות הנחיות הצפנה ממליצים על אישור של פעילות מחייבת מטרה לנוגדן עם כריכה חיסונית21. במקרה זה אנו מודדים את הנוגדנים שלנו וכוח של כריכה על ידי בכתם חיסוני על lysates תא שלם מוכן שבב (איור 6). אנו אישרו כי הנוגדן נקשר CsgD-3xFLAG; הסימנים נגד הדגל ואנטי CsgD מתגלים במשקל המולקולרי הצפוי (28 kDa)22. הליכים שבב לעתים קרובות להניב ריכוזים נמוכים של דנ א. לכן, שיטת טיהור המסירה מזהמים ושומרת על שיעור גבוה של הדנ א נבחר. טיהור מגנטי חרוז נבחר על העמודה מבוסס טיהור כי הוא שמר ריכוזים נמוכים של ה-DNA שבב קלט טוב יותר (איור 7) והסיר מזהמים (נתונים לא מוצגים). בשל כמויות מופחתות של דנ א, הכנת הספרייה של ה-DNA שבב עשוי לדרוש מתאמים מדולל ו-PCR העשרה. לפני קביעת הרצף, ניתן לדמיין את הספריות על-ידי המעקב של Bioanalyzer כדי לאשר את התפלגות הגודל הנכונה לפני ואחרי העשרה (איור 8). בנוסף, אם יש יעד הרגולציה הידוע של מקדם התמלול, qPCR יש להשתמש כדי לאשר העשרה של אזורים מחייב על ידי השוואת שינוי קיפול (∆ ∆ Ct) בין היעד הידוע והתייחסות שפע רצף גנים ב immunoprecipitated ו-DNA קלט sonicated. שבב רצף נתונים צריך להיות מנותח על ידי הקצאת עשרות איכות, זמירה בסיסי איכות נמוכה, יישור קדימה וקריאות הפוכה (ברצף לזווג סוף), הרכבת לגנום התייחסות באיכות גבוהה, מציאת פסגות מעל הרקע, וביצוע ניתוח במורדהזרם(איור 9א). ניתוח במורד הזרם אמור לכלול הדמיה וביאור של פסגות, עקביות עם דגימות שכפול ביולוגיות, וניתוח מוטיב, והוא יכול לכלול ניתוח מחייב דיפרנציאלי בין תנאים או סוגי תאים, ושילוב נתונים עם ביטוי גנים ממסלולים ידועים. לנתוני שבב-seq כגון שלנו, יש לזהות את הפסגות באופן משמעותי מעל הרקע (איור 9ב, ג, ברים אדומים) עם קביעת ערך p , לא רק על-ידי שינוי מתקפל. בניתוח הסופי, הקריאות הממופות מודמיינו כנגד הביאור של גנום הייחוס (איור 9ד). תוצאת שבבים עלובה תופיע כקלט-seq ללא פסגות משמעותיות מעל הרקע. איור 1: איור של צעדים ב-שבב seq עם ביואמים חיידקיים. בהליך המתואר, S. התאים מגודלים ב-1% בקבוקון טריטונים ב -28 ° c עם טלטול (1), מדיה ממוזגת ללא תא מותנית בטיפול בסוגי תאים של ביוilm (2), המשמש לאיסוף כמות נאותה של ביוilm ותאי פלאנקלס (3). תאים אלה נשטפים עם PBS ו הומוגניים כדי להפריד בין ביוilm (4). חלבונים הם מקושרים ל-DNA עם פוליאתילן קשר פורמלדהיד, ולאחר מכן תאים לשחרר את תוכן התא (5). ה-DNA בתא הליפוסט מפוצל על ידי sonication (6). ה-DNA להצליב את החלבון היעד נבחר דרך immunoprecipitation עם נוגדן הנקשר חלבון היעד ו-G חלבון מגנטי חרוזים (7). ה-DNA שנבחר הוא שטף ומוברג מ-חלבון G חרוזים מגנטיים (8) ומטוהר להכנת הספרייה ורצף (9). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: בבקבוקון מבחנה עבור הלומדים S. . התפתחות היוהימוופיום (A) S. תאים מסוג typhimurium גדלו ב 1% טריטונים עבור 13 h ב -28 ° c לעבור החלפת פנוטיפ ליצירת מצרפים של ביוilm ותאי פלנקטון בשלב הנוזלי של תרבות הבקבוקון. (ב) אגרגטים ביוקליקס ותאי פלנקטון מתרבות הבקבוקון ב (א) הופרדו באמצעות 210 צנטריפוגה x g עבור 2 דקות. והגלולה נקצרו עבור. ההכנות של תאי השימוש בתאים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 3: ריכוזי החלבון הכולל של תאי הפלאנקקלס ודגימות התאים שנקטפו מ- S. . תרבות היסטרמוופיום ממטרי חלבון צביעה בוצעו וכמויות חלבונים ביחס לעקומת BSA סטנדרטי נמדדו ב 750 ננומטר. תוכן חלבונים של דגימות תא פלנקטון בשעה 4.0, 6.0, ו 8.0 OD600 הושוו ל 30 מ ג של אגרגטים ביוilm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: הומוזציה של דגימות תאים מ -S. . בקבוקון התרבויות (א) מצרפים של ביוilm מתרבית בקבוקון שהושעו ב-PBS (שמאל) היו הומוגניים באמצעות טחנת מערבל ב -30 הרץ עבור 5 דקות (מימין). (ב) התאים planktonic מתוך תרבות בקבוקון מחדש ב-PBS עובדו על ידי טחנת מיקסר ב 30 הרץ עבור 5 דקות כדי להבטיח עקביות בין דגימות סוג תא. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: שיטת Sonication עם הליטים של התאים הקדם-שבב. התאים הצבורים והפלקוניים של הדגמים הופרדו, הומוגניים, מקושרים ומחוברים. DNA-חלבון מתחמי היו sonicated עד 8 פעמים ב 30 s ב ו 2 דקות הנחה על הקרח כדי לשבור את ה-DNA לרסיסים קטנים יותר. חלק מsonicated ליפוסט הופרד ב -2% ג’ל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: כריכת היעד כריכה ספציפיות של נוגדן נגד דגלים המשמשים שבב-seq. הנוגדן ספציפיות הוערך על ידי החיסונית לפני lysates כולו מוכן תרבויות בקבוקון של S. . זנים של היסטרמויום כמוצג הזנים ∆ csgd + p3xFLAG/csgd ו-WT ביויוilm דגימות לייצג אגרגטים ביוייצו שנקטפו מצלוחיות, בעוד זן ∆csgd ± p3xFLAG ו התאים WT פלנקטון לייצג תאים פלנקטון. מטוהרים שלו-מתויג CsgD היה טעון כפקד. כל התאים הסלולריים היו מנורמטים כך 30 μg של חלבון מוחלט נותחו בכל נתיב. המספרים בצד שמאל מתייחסים לגודל (ב-kDa) של סמני משקל מולקולרי מראש. הנוגדן העיקרי המשמש לכתם העליון היה נוגדן שבטיים הארנב-נגד-דגל (סיגמא-אולדריץ ‘ #F7425), ואילו הכתם התחתון היה מודבטים עם הארנב נגד הדגל יחד עם נוגדן שבטיים ספציפי CsgD2. עז נגד ארנב IgG (LiCor IRDye 680RD, 925-68071) ומניעת שימוש בעכבר עז (LiCor IRDye 800CW, 925-32210) שימשו נוגדנים משניים. אותות פלורסנט היו דמיינו באמצעות מערכת הדמיה האודיסיאה CLx ו תמונה סטודיו 4.0 חבילת תוכנה (Li-Cor ביוטכנולוגיה). תמונות מייצגות מוצגות. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: העמודה-או מגנטי חרוז מבוססי אסטרטגיות טיהור עבור כמויות קטנות של דנ א כתוצאה מניסויים שבב-seq. דגימות של כמויות ידועות של ה-DNA היו מטוהרים באמצעות מבוססי טור ערכות או חרוזים מגנטיים ואת הריכוז של האלוטה נמדד לאחר טיהור. חרוזים מגנטיים הראו התאוששות טובה יותר ברמות DNA נמוכות, בדומה כמויות נמוכות של DNA בדרך כלל נתקל בסוף פרוטוקול שבב-seq, אבל לפני ההכנה ספריית NGS. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: ההכנות ל-DNA שבב וספריות עוקבות דמיינו על ידי Bioanalyzer. (A) בגודל החלק הממוצע של דנ א גנומית לאחר הליזה התאים ו sonication היה < 1000 bp, עם רוב של שברים 200-500 bp טווח. (ב) חומר התחלתי להכנת הספרייה היה מתחת לזיהוי. (ג) הארכה של מתאם ו-PCR העשרה מאפשרת הגברה של חלקי ספרייה. (ד) הכנה בספרייה המסכנה יש פסגות DNA נמוכות, בצורת מוזר או פסגות משקל מולקולרי גבוה, או פסגות מתאם שופע ב כ 100 Bp. נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: נתוני שבב-seq נותחו באמצעות כלים ביולוגיים ודמיינו בדפדפן הגנום. A. תרשים זרימה עבור ניתוח ביולוגי אופייני של נתוני שבב-seq. קריאות Raw עבור ביוilm (∆csgd זן + p3xFLAG/csgd) ו תאים פלנקטון (∆csgd + p3xFLAG) נוקו לקריאה באיכות נמוכה מתאמים, וממופה ל S. הגנום 14028s הגנום (NC_016856 0.1 עבור כרומוזום וNC_016855 0.1 עבור הפלבאמצע) על ידי Bowtie2 (v 2.3.3.1) עם פרמטרים ברירת המחדל23. MACS2 (v 2.1.2) שימש כדי לקרוא את הפסגות עם פרמטרים של ‘-q 0.01–nomodel ‘, לקיחת משכפל של ביוilm כערכות נתונים בדיקות ואלה כאשר שליטה24. מודול MACS2 bdgcmp היה בשימוש נוסף כדי ליצור מסלול העשרה מתקפל עם פרמטרים של ‘-m FE ‘. קובץ השיא המשמעותי עם מסלול העשרה מתקפל הוסב לקובץ פאה באמצעות bedtools/בדקליפ/Bedגראטוביפאה25 ודמיינו על הגנום התייחסות באמצעות מציג גנומיקה אינטגרטיבית v 2.5.126. פסגות מייצגים מוצגים (פסים אדומים). (ב) אזור גדול של ~ 40 kbp, המכיל פסגות מרובות, הוא תוצאה לא-מרבית, אך עדיין בעל ערך פוטנציאלי. (ג) זוהי תוצאה טיפוסית יותר, המציגה שני אזורי שיא משמעותיים. (ד) התקרבות בפסגה השמאלית ב-C, המציגה קריאות מיפוי לאזור S. הגנום 14028s המכיל היזמים מפוצלים של Uspa ו uspb. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. מאגרי פירוק תאים מאגר לוליזיס 50 mM טריס-HCl pH 8.1 10 מילימטר EDTA 1% SDS מעכבי פרוטאז מאגר דילול IP 20 מ”מ טריס-HCl pH 8.1 2 מילימטר EDTA 150 ממ י 1% טריטון X-100 0.01% SDS מאגרי Immunoprecipitation מאגר שטיפת IP 1 20 מ”מ טריס-HCl pH 8.1 2 מילימטר EDTA 50 ממ י 1% טריטון X-100 0.1% SDS מאגר שטיפת IP 2 10 מילימטר טריס-HCl pH 8.1 250 מ ל ליקיל 1 מילימטר EDTA 1% NP-40 1% חומצה דיאוקסיכופילית TE (T10E1) pH 8.0 10 מילימטר טריס-HCl 1 מילימטר EDTA מאגר הימנעות 1% SDS 100 מ”מ NaHCO3 . שולחן 1 מתכונים מאגר.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לביצוע שבב-seq עם סלמונלה enterica serovar ביויויום ותאי פלנקטון מהתרבות הטהורה, כדי למצוא מטרות רגולטוריות של הרגולטור הראשי של ביוilm, csgd. אנו מצפים למידע כריכה משלים בשל היציבות הדו של csgd בשני סוגי התא, עם רמות גבוהות באגרגטים של ביוilm ורמות נמוכות בתאי פלנקטון2,3. עם זאת, טכניקה זו יכולה להיות גם להחיל על גורמים אחרים בקטריות שעתוק, סוגי תאים, או תנאי גדילה. בפרט, טכניקה זו יכולה להיות מותאמת לביואמים בקטריאליים אחרים באמצעות פקטור המרה קבוע של CFU למשקל יחידה של תאי ביויוונים.

שבב-seq יכול להיות נוטה הגברה של שגיאה טכנית באמצעות רצף; עם זאת, אישור בשלבים קריטיים יכול למנוע27זה. ספציפיות נוגדן עיקרי חשוב לבחור רק את מקדם שעתוק היעד ואת ה-DNA הוא שולט במהלך immunoprecipitation7. בניסוי זה, Csgd היה התמזגו תג פלאסיים מקודד 3xFLAG בקצה 3 ‘ של הגן, המתאים C-הטרמינוס של csgd22. P3xFLAG פלמיד ללא csgD שימש “שליטה” (S. Typhimurium 14028 ∆ csgD + p3xFLAG). הנחיות הצפנה ממליצים ביצוע החומרים האימונוts עם הנוגדן העיקרי נגד חלבון הריבית, ו lysates של זני שבב מחיקה זנים21. חשוב להבטיח שתנאי הגדילה יהיו עקביים באמצעות שכפול כדי להפחית את השונות בכריכה של גורם שעתוק ובתוצאות רצף הזרם. אם מישהו מקפיד להבטיח את הגודל ותנאי הגדילה הטרום-מוגדרים עקביים, הגידול הביואמיל בתרבות הבקבוקון הוא עקבי4. חשוב לאשר כי כל הביו, התפרקה לאחר לקות המגון, כדי להבטיח גישה שווה של ריאגנטים, במיוחד פורמלדהיד צולבות מקשר, לכל התאים.

מספר שינויים עשויים לאפשר לחוקרים להשתמש בפרוטוקול זה עבור החלבונים אחרים המחייבים DNA, סוגי תאים, זנים, תנאי גדילה, או ציוד מעבדה. אם הוא משמש עבור מינים היוצרים של ביוונים מאשר S. Typhimurium, גורם ההמרה של המושבה להרכיב יחידות למשקל יחידה של ביוilm צריך להיות באופן קבוע הניסויים על ידי איסוף כמויות שונות של ביוilm, הומוגניזציה באופן יסודי, וביצוע מדלל סדרתי וספירת צלחות כדי ליצור עיקול רגיל, אשר עשוי לא להיות מדויק על משקולות נמוכה יותר משקל2 Sonicator העברת אנרגיה תא התנגדות סוג עשוי להיות שונה; לפיכך, sonication מומלץ למצוא את מספר ההתפרצויות הsonication שיפיקו את טווח גודל הקטע הנדרש עבור הכנת הספרייה ורצף11של המטה. פיצול כרומטין על ידי מmicrococcal נוקלאז היא חלופה sonication המייצרת ברזולוציה גבוהה של אתרי תפוסת; עם זאת, שיטה זו עשויה להציג פיצולהטיה 7,28. את טווח גודל ה-DNA ניתן לשנות בהתאם ערכות הכנה ספריית במטה ופלטפורמות רצף. ניתן להשתמש בשיטות אחרות של הומוגון במקום טחנת המיקסר. לדוגמה, הומוגניצר רקמת זכוכית עשוי להיות מוחלף, אבל זה עשוי ניקה או באופן מוחלט לשבור את הבייוilm. במונחים של שולטת, pre-immunoprecipitate DNA ניתן לנרמל בעיבוד לאחר רצפי וניתוח. בקרת מדמה-IP עם מינים התואמים סרום רגיל יכול לשמש כפקד כמו גם13.

החוקרים חייבים לשקול את המגבלות על שיטה זו כאשר בהתחשב ניסוי שבב-seq. ייתכן שיהיה צורך בשינויים משמעותיים כדי להתאים אותו לסוגי ביוונים אחרים. לדוגמה, עם סלמונלה typhimurium מיידית השעיית מחדש של ביוilm ב-PBS מוביל לאובדן מדיד של אגרגטים ביוilm. Immunoprecipitation פילוח מטרות רגולטוריות של גורמי שעתוק בחיידקים עלול לגרום כמויות קטנות מאוד של דנ א, אשר הוא אתגר לטיהור ואיתור בשלבים מאוחרים יותר. הטיה ניתן להציג במהלך הטיה מניפולציה במורד במהלך זיהוי הספרייה9. בנוסף, שיטה זו אינה חושפת ברמות ביטויים vivo בתגובה לכריכה של גורם שעתוק. חוקרים בעלי ניסיון מועט בביואינפורמטיקה עשויים להיות מאותגרים על-ידי צינור הניתוח. שיטה זו עשויה להיות אינטנסיבית ויקרה בזמן; עם זאת, עלות הרצף נמוכה לעתים קרובות ממיקרו-מערך והיא יורדת לאורך זמן כאשר השיפורים הטכנולוגיים ממשיכים להתבצע.

כמה שיטות בספרות לתאר שבב עם חיידקים, והניסויים החיידקיים ביותר להתחיל במצב גדילה פשוטה13,14,15,17,18. ההכנה לדגימת שבב עם תאים בודדים היא פשוטה ומציגה פחות אתגרים מאשר הכנה לדגימת שבב עם אגרגטים של ביוilm. באשר שבב-seq, השיטות הקודמות של לימוד המעגלים cis-רגולציה, כולל האבולוציה שיטתית של ליגניות על ידי העשרה מעריכית (SELEX), הניידות electrophoretic משמרת (EMSA), שבב שבב, מחיקה מקדם וניתוח עיתונאי השלימה או הוחלף על ידי שבב-seq29. שבב-seq הוא החלפת שבב שבב בשל התקדמות טכנולוגיות וזמינות של רצף. רצף עמוק מספק לחוקרים כמויות אדירות של נתונים שיכולים לזהות אתרים בעלי זיקה מחייבת נמוכה יותר ורזולוציה של זוג בסיסי גבוה יותר עם חומר התחלתי פחות מאשר שבב-שבב11,30. ניתוח של נתוני שבב מתוך אורגניזמים עם התייחסות באיכות גבוהה גנום הוא בדרך כלל מהיר וספציפי. בנוסף, ChIP-seq היא שיטה יסודית לגילוי באתרי הכריכה החזויים שאינם כבושים בכל סוגי התאים, בשלב הגדילה, או בתנאי הסביבה31.

בעתיד, פרוטוקול זה יכול לשמש כדי להקל על הבנה של פתוגנזה בקטריאלי, במיוחד אורגניזמים היוצרים. אימוץ נרחב של טכניקה זו וזמינות של מערכות נתונים חדשות יכולות להוביל לאינטגרציית נתונים כדי לזהות קבוצות של חלבונים הניתנים לשימוש בשיתוף פעולה לשליטה בתהליכים סלולריים במיקרואורגניזמים היוצרים מיקרואורגניזמים32. בנוסף, שבב-seq ו-RNA-seq נתונים ניתן לשלב כדי לבנות מערכת הרגולציה דגמי33.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

מחקר זה היה נתמך על ידי מענק מדעי הטבע והמועצה לחקר ההנדסה (NSERC) (#2017-05737) ל-AW ודרך כיסא Jarislowsky בביוטכנולוגיה. MP היה נתמך על ידי מלגה NSERC-ליצור באמצעות תוכנית הדרכה משולבת מחלות זיהומיות, בטיחות מזון ומדיניות ציבורית (ITraP) באוניברסיטת ססקצ’ואן.

המחברים רוצים להודות לדני דייל על הצילומים והעריכה.

Materials

Agarose powder FroggaBio A87-500G
Balance (Explorer pro) Ohaus EP214
Benchtop Centrifuge (8510R) Eppendorf 022627023
Bioanalyzer 2100 Agilent G2939BA
BR dsDNA kit ThermoFisher Scientific Q32850
ChIP-Grade Protein G Magnetic Beads Cell Signaling Technology 9006
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich COEDTAF-RO ROCHE
Conical tube 15 mL FroggaBio TB15-500
Conical tube 50 mL FroggaBio TB50-500
DC Protein Assay Kit II BioRad 5000112
Disposable Cuvette, 1.5 mL Fisher Scientific 14-955-127
Electrophoresis equipment (mini-PROTEAN) Bio-Rad 1658000
Floor centrifuge (Sorvall Evolution RC) Thermo Scientific 728211
Fluorometer (Qubit 3.0) Thermo Fisher Scientific Q33216
Formaldehyde Sigma-Aldrich 252549
GelRed® Nucleic Acid Gel Stain 10 000x in water Biotium 41003
High Sensitivity DNA kit Agilent 5067-4626
Incubator (shaking) VWR 1570-ZZMFG
Incubator (Water bath shaking) New Brunswick G76D
LB media VWR 90000-808
Magnetic stand (DynaMag) Fisher Scientific 12321D
Microcentrifuge (refrigerated) Eppendorf 5415R
Microcentrifuge Tubes, 1.5mL Fisher Scientific 05-408-129
MiSeq Reagent Kit v3 (150 cycle) Illumina MS-102-3001
Mixer mill Retsch MM400
Nalgene 115 mL Filter Units, Sterile, 0.2 µm pore size Thermo Scientific 73520-980
NEBNext Ultra DNA Library Prep Kit for Illumina New England BioLabs E7370S
NGS Cleanup and Size Select magnetic beads Machery-Nagel 744970.5
Normal mouse serum AbCam ab188776
Petri Dishes with Clear Lid (100 mm x 15 mm) Fisher Scientific FB0875712
Pipette controller FroggaBio MP001
Proteinase K ThermoFisher Scientific AM2542
QIAquick PCR Purification Kit Qiagen 28104
Rabbit Anti-FLAG Polyclonal Antibody Sigma-Aldrich F7425
RNase A (10 mg/mL; DNase and protease-free) ThermoFisher Scientific EN0531
Rotating wheel Crystal Technologies & Industries TR 01A
Safe-Lock Tubes (2.0 mL, colorless) Eppendorf 22363344
Serological pipette 25 mL FroggaBio 94024
Spectrophotometer Montreal Biotech Inc. Libra S22
Stainless Steel Beads, 5 mm Qiagen 69989
Tapered microtip 1/8" (3mm) Sonicator probe Sonics & Materials, Inc. 630-0418
Tryptone media VWR 90000-286
Ultrasonic Liquid Processor (Sonicator) Sonics & Materials, Inc. VC300
Vacuum equipment (Vacufuge plus) Eppendorf 022820001
Water bath 1 (Lab-line aquabath) Thermo Scientific 18000-1
Water bath 2 (Precision) Thermo Scientific 51221044
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Costerton, J. W., Stewart, P. S., Greenberg, E. P. Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections. Science. 284 (5418), 1318-1322 (1999).
  2. MacKenzie, K. D., et al. Bistable Expression of CsgD in Salmonella enterica Serovar Typhimurium Connects Virulence to Persistence. Infection and Immunity. 83 (6), 2312-2326 (2015).
  3. Grantcharova, N., Peters, V., Monteiro, C., Zakikhany, K., Römling, U. Bistable expression of CsgD in biofilm development of Salmonella enterica serovar typhimurium. Journal of Bacteriology. 192 (2), 456-466 (2010).
  4. MacKenzie, K. D., Palmer, M. B., Köster, W. L., White, A. P. Examining the Link between Biofilm Formation and the Ability of Pathogenic Salmonella Strains to Colonize Multiple Host Species. Frontiers in Veterinary Science. 4, 307 (2017).
  5. Steenackers, H., Hermans, K., Vanderleyden, J. Salmonella biofilms: an overview on occurrence, structure, regulation and eradication. Food Research International. 45 (2), 502-531 (2012).
  6. Brombacher, E., Dorel, C., Zehnder, A. J. B., Landini, P. The curli biosynthesis regulator CsgD co-ordinates the expression of both positive and negative determinants for biofilm formation in Escherichia coli. Microbiology. 149, 2847-2857 (2003).
  7. Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nature Reviews Genetics. 10 (10), 669-680 (2009).
  8. Wu, D. -. Y., Bittencourt, D., Stallcup, M. R., Siegmund, K. D. Identifying differential transcription factor binding in ChIP-seq. Frontiers in Genetics. 6, 169 (2015).
  9. Valouev, A., et al. Genome-wide analysis of transcription factor binding sites based on ChIP-Seq data. Nature Methods. 5 (9), 829-834 (2008).
  10. Lieb, J. D. Genome-wide mapping of protein-DNA interactions by chromatin immunoprecipitation and DNA microarray hybridization. Methods in Molecular Biology. 224, 99-109 (2003).
  11. Robertson, G., et al. Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing. Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).
  12. Kim, T. H., et al. A high-resolution map of active promoters in the human genome. Nature. 436 (7052), 876-880 (2005).
  13. Dillon, S. C., et al. Genome-wide analysis of the H-NS and Sfh regulatory networks in Salmonella Typhimurium identifies a plasmid-encoded transcription silencing mechanism. Molecular Microbiology. 76 (5), 1250-1265 (2010).
  14. Perkins, T. T., et al. ChIP-seq and transcriptome analysis of the OmpR regulon of Salmonella enterica serovars Typhi and Typhimurium reveals accessory genes implicated in host colonization. Molecular Microbiology. 87 (3), 526-538 (2013).
  15. Gu, D., Liu, H., Yang, Z., Zhang, Y., Wang, Q. Chromatin Immunoprecipitation Sequencing Technology Reveals Global Regulatory Roles of Low-Cell-Density Quorum-Sensing Regulator AphA in the Pathogen Vibrio alginolyticus. Journal of Bacteriology. 198 (21), 2985-2999 (2016).
  16. Peano, C., et al. Characterization of the Escherichia coli σ(S) core regulon by Chromatin Immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq) analysis. Scientific Reports. 5 (1), 10469 (2015).
  17. Blasco, B., et al. Virulence regulator EspR of Mycobacterium tuberculosis is a nucleoid-associated protein. PLoS Pathogens. 8 (3), 1002621 (2012).
  18. Jones, C. J., et al. ChIP-Seq and RNA-Seq reveal an AmrZ-mediated mechanism for cyclic di-GMP synthesis and biofilm development by Pseudomonas aeruginosa. PLoS pathogens. 10 (3), 1003984 (2014).
  19. Sengupta, M., Jain, V., Wilkinson, B. J., Jayaswal, R. K. Chromatin immunoprecipitation identifies genes under direct VraSR regulation in Staphylococcus aureus. Canadian Journal of Microbiology. 58 (6), 703-708 (2012).
  20. . Cross-linking chromatin immunoprecipitation (X-ChIP) protocol Available from: https://www.abcam.com/ps/pdf/protocols/x_CHip_protocol.pdf (2017)
  21. Landt, S. G., et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia. Genome Research. 22 (9), 1813-1831 (2012).
  22. MacKenzie, K. D., et al. Parallel evolution leading to impaired biofilm formation in invasive Salmonella strains. PLoS Genetics. 15 (6), 1008233 (2019).
  23. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357-359 (2012).
  24. Zhang, Y., et al. Model-based analysis of ChIP-Seq (MACS). Genome Biology. 9 (9), 137-139 (2008).
  25. Quinlan, A. R., Hall, I. M. BEDTools: a flexible suite of utilities for comparing genomic features. Bioinformatics. 26 (6), 841-842 (2010).
  26. Thorvaldsdóttir, H., Robinson, J. T., Mesirov, J. P. Integrative Genomics Viewer (IGV): high-performance genomics data visualization and exploration. Briefings in Bioinformatics. 14 (2), 178-192 (2013).
  27. Schoppee Bortz, P. D., Wamhoff, B. R. Chromatin immunoprecipitation (ChIP): revisiting the efficacy of sample preparation, sonication, quantification of sheared DNA, and analysis via PCR. PloS One. 6 (10), 26015 (2011).
  28. Tolstorukov, M. Y., Kharchenko, P. V., Goldman, J. A., Kingston, R. E., Park, P. J. Comparative analysis of H2A.Z nucleosome organization in the human and yeast genomes. Genome Research. 19 (6), 967-977 (2009).
  29. Geertz, M., Maerkl, S. J. Experimental strategies for studying transcription factor-DNA binding specificities. Briefings in Functional Genomics. 9 (5-6), 362-373 (2010).
  30. Mardis, E. R. ChIP-seq: welcome to the new frontier. Nature Methods. 4 (8), 613-614 (2007).
  31. Lee, T. I., et al. Transcriptional regulatory networks in Saccharomyces cerevisiae. Science. 298 (5594), 799-804 (2002).
  32. Wade, J. T., Struhl, K., Busby, S. J. W., Grainger, D. C. Genomic analysis of protein-DNA interactions in bacteria: insights into transcription and chromosome organization. Molecular Microbiology. 65 (1), 21-26 (2007).
  33. Myers, K. S., Park, D. M., Beauchene, N. A., Kiley, P. J. Defining bacterial regulons using ChIP-seq. Methods (San Diego, Calif). 86, 80-88 (2015).

Tags

Keywords: ChIP-seqChromatin ImmunoprecipitationTranscription FactorsDNA-binding ProteinsSalmonellaBiofilmsCsgDGene RegulationBacterial Gene ExpressionHigh-throughput SequencingRegulatory Targets
check_url/pt/60736?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Palmer, M. B., Wang, Y., White, A. P. Discovering CsgD Regulatory Targets in Salmonella Biofilm Using Chromatin Immunoprecipitation and High-Throughput Sequencing (ChIP-seq). J. Vis. Exp. (155), e60736, doi:10.3791/60736 (2020).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image