TurboID-baserad närhetsmärkning för planta-identifiering av protein-proteininteraktionsnätverk
Summary
Beskrivs här är en närhet märkning metod för identifiering av interaktion partner i TIR domänen nlr immun receptorn i Nicotiana benthamiana blad vävnad. Dessutom tillhandahålls ett detaljerat protokoll för identifiering av interaktioner mellan andra proteiner av intresse med hjälp av denna teknik i Nicotiana och andra växtarter.
Abstract
Tekniker för närhetsmärkning (PL) med hjälp av konstruerade ascorbatperoxidas (APEX) eller Escherichia coli biotin ligase BirA (känd som BioID) har framgångsrikt använts för identifiering av protein-proteininteraktioner (PROPO) i däggdjursceller. Kraven på toxisk väteperoxid (H2O2)i APEX-baserad PL, längre inkubationstid med biotin (16–24 h) och högre inkubationstemperatur (37 °C) i BioID-baserade PL begränsar dock kraftigt deras tillämpningar i växter. Den nyligen beskrivna TurboID-baserade PL behandlar många begränsningar av BioID och APEX. TurboID möjliggör snabb närhetsmärkning av proteiner på bara 10 min under rumstemperatur (RT) förhållanden. Även om nyttan av TurboID har visats i djurmodeller, visade vi nyligen att TurboID-baserade PL presterar bättre i växter jämfört med BioID för märkning av proteiner som är proximala till ett protein av intresse. Tillhandahålls här är ett steg-för-steg-protokoll för identifiering av protein interaktion partner med hjälp av N-terminal Toll/interleukin-1 receptorn (TIR) domän av nukleotid-bindande leucin-rika upprepa (NLR) protein familj som modell. Metoden beskriver vektorkonstruktion, agroinfiltration av proteinuttryckskonstruktioner, biotinbehandling, proteinutvinning och avsaltning, kvantifiering och anrikning av de biotinylerade proteinerna genom affinitetsrening. Det protokoll som beskrivs här kan enkelt anpassas för att studera andra proteiner av intresse för Nicotiana och andra växtarter.
Introduction
Prothämmare är grunden för olika cellulära processer. Traditionella metoder för att identifiera prokrommor inkluderar svamp-två-hybrid (Y2H) screening och immunprecipitation i kombination med masspektrometri (IP-MS)1. Båda lider dock av vissa nackdelar. Y2H-screening kräver till exempel att måldjurs- eller djurarter finns tillgängliga för Y2H-bibliotek. Byggandet av dessa bibliotek är arbetsintensivt och dyrt. Dessutom utförs Y2H-metoden i den heterologa eukaryota organismjästen med en cell, som kanske inte representerar cellulära status för högre eukaryota celler.
Däremot visar IP-MS låg effektivitet i att fånga övergående eller svaga probetalare, och det är också olämpligt för de proteiner med lågt överflöd eller hög hydrofobabilitet. Många viktiga proteiner som är involverade i växtsignaleringsvägarna såsom receptorliknande kinaser (RLKs) eller NLR-familjen av immunreceptorer uttrycks på låga nivåer och interagerar ofta med andra proteiner övergående. Därför begränsar det i hög grad förståelsen av mekanismer som ligger till grund för regleringen av dessa proteiner.
Nyligen har närhetsmärkning (PL) metoder baserade på konstruerade ascorbateperoxidas (APEX) och en mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (känd som BioID) har utvecklats och utnyttjats för studier av probetalare2,3,4. Principen för PL är att ett målprotein av intresse är smält med ett enzym, som katalyserar bildandet av labile biotinyl-AMP (bio-AMP). Dessa fria bio-AMP frigörs av PL enzymer och diffusa till närheten av målet proteinet, vilket gör biotinylation av proximala proteiner vid de primära aminer inom en beräknad radie av 10 nm5.
Detta tillvägagångssätt har betydande fördelar jämfört med de traditionella Y2H- och IP-MS-metoderna, såsom förmågan att fånga övergående eller svaga protlyiditeter. Dessutom tillåter PL märkning av proximala proteiner av målproteinet i sina inhemska cellulära miljöer. Olika PL enzymer har unika nackdelar när de appliceras på olika system. Till exempel, även om APEX erbjuder högre märkning kinetik jämfört med BioID och framgångsrikt tillämpas i däggdjurssystem, kravet på giftiga väteperoxid (H2O2) i detta tillvägagångssätt gör det olämpligt för PL-studier i växter.
Däremot undviker BioID-baserade PL användning av giftiga H2O2, men graden av märkning är långsam (kräver 18-24 h för att slutföra biotinylation), vilket gör fångsten av övergående prolkys mindre effektiv. Dessutom medför den högre inkubationstemperatur (37 °C) som krävs för effektiv PL av BioID yttre stress för vissa organismer, såsom växter4. Därför har begränsad användning av BioID-baserade PL i växter (dvs. ris protoplaster, Arabidopsis, och N. benthamiana) rapporterats6,7,8,9. Den nyligen beskrivna TurboID enzym övervinner bristerna i APEX och BioID-baserade PL. TurboID visade hög aktivitet som gör det möjligt att uppnå PL inom 10 min på RT10. TurboID-baserade PL har framgångsrikt tillämpats i däggdjursceller, flugor och maskar10. Nyligen har vi och andra forskargrupper självständigt optimerat och utökat användningen av TurboID-baserade PL för att studera prober i olika växtsystem, inklusive N. benthamiana och Arabidopsis växter och tomat håriga rötter11,12,13,14. Jämförande analyser visade att TurboID presterar bättre för PL i anläggningar jämfört med BioID11,14. Det har också visat robustheten hos TurboID-baserade PL i planta genom att identifiera ett antal nya interaktioner med en NLR immunreceptor11, ett protein vars interaktionspartners vanligtvis är svåra att få med traditionella metoder.
Detta protokoll illustrerar TurboID-baserade PL i planta genom att beskriva identifiering av interaktion proteiner av N-terminal TIR domän nlr immunreceptorn i N. benthamiana växter. Metoden kan utvidgas till alla proteiner av intresse i N. benthamiana. Ännu viktigare, det ger en viktig referens för att undersöka protidies i andra växtarter som Arabidopsis,tomat, och andra.
Protocol
Representative Results
Discussion
TurboID biotin ligase genereras av jäst display-baserad riktad utveckling av BioID10. Det har många fördelar jämfört med andra PL enzymer. TurboID tillåter tillämpning av PL till andra modellsystem, inklusive flugor och maskar, vars optimala tillväxttemperatur är runt 25 °C10. Även om PL-metoden har använts i stor utsträckning i djursystem är dess tillämpning i växter begränsad. Protokollet beskrivs här ger en steg-för-steg förfarande för att upprätta …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av bidrag från National Transgenic Science and Technology Program (2019ZX08010-003 till Y.Z.), National Natural Science Foundation of China (31872637 till Y.Z.)) och grundforskningsfonderna för de centrala universiteten (2019TC028 till Y.Z.) och NSF-IOS-1354434, NSF-IOS-1339185, och NIH-GM132582-01 till S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
Referências
- Berggård, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7 (16), 2833-2842 (2007).
- Kim, D. I., Roux, K. J. Filling the void: proximity-based labeling of proteins in living cells. Trends in Cell Biology. 26 (11), 804-817 (2016).
- Li, P., Li, J., Wang, L., Di, L. J. Proximity labeling of interacting proteins: Application of BioID as a discovery tool. Proteomics. 17 (20), (2017).
- Roux, K. J., Kim, D. I., Raida, M., Burke, B. A promiscuous biotin ligase fusion protein identifies proximal and interacting proteins in mammalian cells. Journal of Cell Biology. 196 (6), 801-810 (2012).
- Kim, D. I., et al. Probing nuclear pore complex architecture with proximity-dependent biotinylation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (24), 2453-2461 (2014).
- Lin, Q., et al. Screening of proximal and interacting proteins in rice protoplasts by proximity-dependent biotinylation. Frontiers in Plant Science. 8 (749), (2017).
- Khan, M., Youn, J. Y., Gingras, A. C., Subramaniam, R., Desveaux, D. In planta proximity dependent biotin identification (BioID). Scientific Reports. 8 (1), 9212 (2018).
- Conlan, B., Stoll, T., Gorman, J. J., Saur, I., Rathjen, J. P. Development of a rapid in planta BioID system as a probe for plasma membrane-associated immunity proteins. Frontiers in Plant Science. 9 (1882), (2018).
- Macharia, M. W., Tan, W. Y. Z., Das, P. P., Naqvi, N. I., Wong, S. M. Proximity-dependent biotinylation screening identifies NbHYPK as a novel interacting partner of ATG8 in plants. BMC Plant Biology. 19 (1), 326 (2019).
- Branon, T. C., et al. Efficient proximity labeling in living cells and organisms with TurboID. Nature Biotechnology. 36 (9), 880-887 (2018).
- Zhang, Y., et al. TurboID-based proximity labeling reveals that UBR7 is a regulator of N NLR immune receptor-mediated immunity. Nature Communications. 10 (1), 3252 (2019).
- Arora, D., et al. Establishment of proximity-dependent biotinylation approaches in different plant model systems. bioRxiv. , (2019).
- Kim, T. W., et al. Application of TurboID-mediated proximity labeling for mapping a GSK3 kinase signaling network in Arabidopsis. bioRxiv. , (2019).
- Mair, A., Xu, S. L., Branon, T. C., Ting, A. Y., Bergmann, D. C. Proximity labeling of protein complexes and cell-type-specific organellar proteomes in Arabidopsis enabled by TurboID. eLife. 8, 47864 (2019).
- Yuan, C., et al. A high throughput Barley stripe mosaic virus vector for virus induced gene silencing in monocots and dicots. PLoS ONE. 6 (10), 26468 (2011).
- McCormac, A. C., Elliott, M. C., Chen, D. F. A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation. Molecular Biotechnology. 9 (2), 155-159 (1998).
- Gingras, A. C., Abe, K. T., Raught, B. Getting to know the neighborhood: using proximity-dependent biotinylation to characterize protein complexes and map organelles. Current Opinion in Chemical Biology. 48, 44-54 (2019).
- Firat-Karalar, E. N., Rauniyar, N., Yates, J. R., Stearns, T. Proximity Interactions among centrosome components identify regulators of centriole duplication. Current Biology. 24 (6), 664-670 (2014).
- Shen, J., et al. Organelle pH in the Arabidopsis endomembrane system. Molecular Plant. 6 (5), 1419-1437 (2013).
- Bally, J., et al. The rise and rise of Nicotiana benthamiana: a plant for all reasons. Annual Review of Phytopathology. 56 (1), 405-426 (2018).
