Étiquetage de proximité basé sur TurboID pour l’identification dans planta des réseaux d’interaction protéines-protéines
Summary
Décrit ici est une méthode d’étiquetage de proximité pour l’identification des partenaires d’interaction du domaine TIR du récepteur immunitaire NLR dans le tissu foliaire de Nicotiana benthamiana. Un protocole détaillé pour l’identification des interactions entre d’autres protéines d’intérêt utilisant cette technique à Nicotiana et d’autres espèces végétales est également fourni.
Abstract
Les techniques d’étiquetage de proximité (PL) utilisant l’acérétique peroxidase (APEX) ou escherichia coli biotin ligase BirA (connue sous le nom de BioID) ont été utilisées avec succès pour identifier les interactions protéines-protéines (IPP) dans les cellules des mammifères. Cependant, les exigences de peroxyde d’hydrogène toxique (H2O2) dans le PL basé sur APEX, le temps d’incubation plus long avec la biotine (16-24 h), et la température d’incubation plus élevée (37 oC) dans le PL basé sur BioID limitent sévèrement leurs applications dans les plantes. Le PL, récemment décrit par TurboID, traite de nombreuses limites de BioID et d’APEX. TurboID permet l’étiquetage de proximité rapide des protéines en seulement 10 minutes dans des conditions à température ambiante (RT). Bien que l’utilité de TurboID a été démontrée dans les modèles animaux, nous avons récemment montré que TurboID-basé PL effectue mieux dans les plantes par rapport à BioID pour l’étiquetage des protéines qui sont proximales à une protéine d’intérêt. Il est prévu ici un protocole étape par étape pour l’identification des partenaires d’interaction protéique à l’aide du domaine du récepteur N-terminal Toll/interleukin-1 (TIR) de la famille de protéines riches en leucine nucléotide-contraignante (NLR) comme modèle. La méthode décrit la construction vectorielle, l’agroinfiltration des constructions d’expression protéique, le traitement de la biotine, l’extraction et le desalting des protéines, la quantification et l’enrichissement des protéines biotinées par purification d’affinité. Le protocole décrit ici peut être facilement adapté pour étudier d’autres protéines d’intérêt pour Nicotiana et d’autres espèces végétales.
Introduction
Les IPP sont à la base de divers processus cellulaires. Les méthodes traditionnelles d’identification des IPP comprennent le dépistage et l’immunoprécipitation de levure-deux hybrides (Y2H) couplés à la spectrométrie de masse (IP-MS)1. Cependant, les deux souffrent de certains inconvénients. Par exemple, le dépistage de L2H nécessite la disponibilité de la bibliothèque Y2H des espèces végétales ou animales cibles. La construction de ces bibliothèques est exigeante en main-d’œuvre et coûteuse. En outre, l’approche Y2H est effectuée dans la levure hétérologique d’organisme eucaryote à cellule unique, qui peut ne pas représenter le statut cellulaire des cellules eucaryotes supérieures.
En revanche, l’IP-MS montre une faible efficacité dans la capture des IPP transitoires ou faibles, et elle n’est pas adaptée aux protéines à faible abondance ou à haute hydrophobicité. De nombreuses protéines importantes impliquées dans les voies de signalisation végétale telles que les kinases récepteurs (RLKs) ou la famille NLR des récepteurs immunitaires sont exprimées à de faibles niveaux et interagissent souvent avec d’autres protéines de façon transitoire. Par conséquent, il restreint considérablement la compréhension des mécanismes sous-jacents à la régulation de ces protéines.
Récemment, des méthodes d’étiquetage de proximité (PL) basées sur l’ascorbate peroxidase (APEX) et un mutant Escherichia coli biotin ligase BirAR118G (connu sous le nom de BioID) ont été développées et utilisées pour l’étude des IPP2,3,4. Le principe de PL est qu’une protéine cible d’intérêt est fusionnée avec une enzyme, qui catalyse la formation de biotinyl-AMP labile (bio-AMP). Ces bio-AMP gratuits sont libérés par les enzymes PL et diffusent à proximité de la protéine cible, permettant la biotinylation des protéines proximales aux amines primaires dans un rayon estimé de 10 nm5.
Cette approche présente des avantages significatifs par rapport aux approches traditionnelles du Y2H et de la SPP, comme la capacité de saisir les IPP transitoires ou faibles. En outre, PL permet l’étiquetage des protéines proximales de la protéine cible dans leurs environnements cellulaires indigènes. Différentes enzymes PL ont des inconvénients uniques lors de leur application à différents systèmes. Par exemple, bien que l’APEX offre une cinétique de marquage plus élevée par rapport à BioID et est appliquée avec succès dans les systèmes de mammifères, l’exigence de peroxyde d’hydrogène toxique (H2O2) dans cette approche le rend impropre aux études de PL dans les plantes.
En revanche, le PL basé sur BioID évite l’utilisation du H2O2toxique, mais le taux d’étiquetage est lent (nécessitant 18-24 h pour compléter la biotinylation), ce qui rend la capture des IPP transitoires moins efficace. En outre, la température d’incubation plus élevée (37 oC) requise pour l’efficacité du PL par BioID introduit un stress externe à certains organismes, tels que les plantes4. Par conséquent, le déploiement limité de PL à base de BioID dans les plantes (c.-à-d. les protoplastes de riz, Arabidopsis et N. benthamiana) a été signalé6,7,8,9. L’enzyme TurboID récemment décrite surmonte les carences de l’APEX et bioID-basé PL. TurboID a montré une forte activité qui permet l’accomplissement de PL dans les 10 minutes à RT10. Le PL à base de TurboID a été appliqué avec succès dans les cellules de mammifères, les mouches et les vers10. Récemment, nous et d’autres groupes de recherche indépendamment optimisé et étendu l’utilisation de TurboID-basé PL pour étudier les IPP dans différents systèmes végétaux, y compris N. benthamiana et Arabidopsis plantes et les racines poilues tomate11,12,13,14. Des analyses comparatives ont indiqué que TurboID obtient de meilleurs résultats pour le PL dans les usines par rapport à BioID11,14. Il a également démontré la robustesse de TURBOID-basé PL dans planta en identifiant un certain nombre de nouvelles interactions avec un récepteur immunitaire NLR11, une protéine dont les partenaires d’interaction sont généralement difficiles à obtenir en utilisant des méthodes traditionnelles.
Ce protocole illustre le PL à base de TurboID en planta en décrivant l’identification des protéines d’interaction du domaine TIR N-terminal du récepteur immunitaire NLR dans les plantes de N. benthamiana. La méthode peut être étendue à toutes les protéines d’intérêt dans N. benthamiana. Plus important encore, il fournit une référence importante pour l’étude des IPP chez d’autres espèces végétales telles que Arabidopsis,tomate, et d’autres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le ligase biotin TurboID est généré par l’évolution dirigée basée sur l’affichage de levure du BioID10. Il a de nombreux avantages par rapport à d’autres enzymes PL. TurboID permet l’application de PL à d’autres systèmes modèles, y compris les mouches et les vers, dont la température de croissance optimale est d’environ 25 oC10. Bien que l’approche PL ait été largement utilisée dans les systèmes animaux, son application dans les plantes est limi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions du Programme national de science et de technologie transgéniques (2019ZX08010-003 à Y.Z.), de la National Natural Science Foundation of China (31872637 à Y.Z.), et des Fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales (2019TC028 à Y.Z.), et du NSF-IOS-1354444444444444444444444444 NSF-IOS-1339185, et NIH-GM132582-01 à S.P.D.K.
Materials
| 721 Spectrophotometer | Metash, made in China | Q/SXFZ6 | For OD600 measurement |
| Ammonium bicarbonate | Sigma | A6141-500G | |
| Biotin | Sigma | B4639-1G | 50 mM Stock |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5702 | |
| Centrifuge | Eppendorf | Centrifuge 5417R | |
| cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11697489001 | |
| Deoxycholic acid | Sigma | D2510-100G | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | VWR Life Science | 0281-25G | |
| Dynabeads MyOne Streptavidin C1 | Invitrogen | 65001 | For affinity purification |
| EDTA | Sigma | E6758-500G | |
| ELISA plate | Corning | Costar 3590 | |
| HEPES | Sigma | H3375-1KG | |
| Hydrochloric acid (HCl) | Fisher Scientific | A144S-212 | |
| Immobilon-P PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | For Western blot analysis |
| Lithium chloride solution(LiCl), 8M | Sigma | L7026-500ML | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Zonkia, made in China | KDC-2046 | For desalting |
| Magnesium Chloride, Hexahydrate (MgCl2·6H2O) | Sigma | M9272-500G | |
| Magnetic rack | Invitrogen | 123.21D | For bead adsorption |
| Multiskan FC Microplate Photometer | Thermo Fisher Scientific | N07710 | For OD595 measurement |
| NP-40 (IGEPAL CA-630) | Sigma | I8896-100ML | |
| Rat anti-HA | Roche | 11867423001 | |
| Rotational mixer | Kylin-Bell Lab Instrument | WH-986 | For IP |
| Shock incubator | Labotery, made in China | ZQPZ-228 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | Fisher Scientific | S271-3 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma | D2510-100G | |
| Sodium dodecyl sulfate(SDS) | Sigma | L4390-1KG | |
| Streptavidin-HRP | Abcam | ab7403 | |
| Triton X-100 | Fisher Scientific | BP151-100 | |
| Trizma base | Sigma | T1503-1KG | |
| Vortex | Scientific Industries | G-560E | |
| Water-jacket Incubator | Blue pard, made in China | GHP-9080 | For Agrobacterium incubation |
| Zeba Spin Desalting Column | Thermo Fisher Scientific | 89893 | For removal of biotin |
Referências
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