Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining
Summary
Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.
Abstract
El estrés oxidativo es un evento importante en condiciones fisiológicas y patológicas. En este estudio, demostramos cómo cuantificar el estrés oxidativo midiendo las especies de oxígeno reactivo total (ROS) utilizando 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción en líneas celulares de cáncer colorrectal como ejemplo. Este protocolo describe los pasos detallados, incluida la preparación de la solución DCFH-DA, la incubación de células con solución DCFH-DA y la medición de la intensidad normalizada. La tinción DCFH-DA es una forma sencilla y rentable de detectar ROS en las células. Se puede utilizar para medir la generación de ROS después de un tratamiento químico o modificaciones genéticas. Por lo tanto, es útil para determinar el estrés oxidativo celular sobre el estrés ambiental, proporcionando pistas para estudios mecanicistas.
Introduction
Tres especies principales de oxígeno reactivo (ROS) producidas por el metabolismo celular que son de significado fisiológico son anión superóxido, radical hidroxilo, y peróxido de hidrógeno1. A bajas concentraciones, participan en procesos celulares fisiológicos, pero a altas concentraciones tienen efectos adversos en las vías de señalización celular1. Nuestro cuerpo ha desarrollado sistemas antioxidantes, que son eficaces contra el exceso de ROS. Sin embargo, el estrés oxidativo puede ocurrir cuando ROS abruma la capacidad desintoxicante de nuestro cuerpo, lo que contribuye a muchas condiciones patológicas, incluyendo inflamación, cáncer, y enfermedad neurodegenerativa2,,3,4. El propósito de este método es determinar el total de ROS celular en las células adherentes utilizando 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) tinción. La razón es que la oxidación de DCFH-DA a 2′-7’diclorofluoresceína (DCF) se ha utilizado ampliamente para la detección total de ROS, incluidos los radicales hidroxilo (•OH) y el dióxido de nitrógeno (•NO2). Mecánicamente, DCFH-DA es tomado por células donde la esterasa celular se corta fuera de los grupos de acetil, lo que resulta en DCFH. La oxidación de DCFH por ROS convierte la molécula a DCF, que emite fluorescencia verde a una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 530 nm. En comparación con la detección de fluorescencia con citometría de flujo y otros métodos alternativos5,las ventajas de este método utilizando un microscopio de fluorescencia y un lector de placas son que produce imágenes fluorescentes claramente visibles, y es fácil de realizar, eficiente y rentable. Este método ha sido ampliamente utilizado para detectar ROS celular para el estudio de diversas condiciones6,7,8. Este protocolo se utiliza para detectar ROS total en células adherentes. El uso de este método para detectar ROS en las células de suspensión puede necesitar algunas modificaciones.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo experimental descrito aquí es fácilmente reproducible para medir el total celular ROS. Los pasos críticos incluyen hacer que la solución DCFH-DA sea fresca y evitar la exposición a la luz, minimizar las perturbaciones del estado de las células y el lavado extenso de PBS justo antes de tomar imágenes. Para la preparación de la solución de trabajo DCFH-DA, la solución de stock debe añadirse a DMEM precalentado justo antes de añadir en la placa de 24 pozos. La razón es que las soluciones antiguas q…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por los Institutos Nacionales de Salud (K01DK114390), una Beca de Becas de Investigación de la Sociedad Americana contra el Cáncer (RSG-18-050-01-NEC), un Proyecto Piloto de Investigación Subvención del Programa de Firma de Salud Ambiental y Superfundo de la Universidad de Nuevo México (P42 ES025589), un Premio al Proyecto Piloto de Recursos Compartidos y un Premio al Proyecto Piloto de Apoyo al Programa de Investigación del Centro Oncológico Integral de la UNM (P30CA118100) , y un nuevo premio de investigador de los Fondos De Investigación Sanitaria Dedicados de la Facultad de Medicina de la Universidad de Nuevo México.
Materials
| 2',7'-Dichlorofluorescein diacetate | Cayman Chemical, Ann Arbor, MI | 20656 | |
| Doxorubicin hydrochloride | TCI America, Portland, OR | D4193-25MG | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium | Corning, Corning, NY | 45000-304 | |
| Ferrous Sulfate Heptahydrate | VWR, Radnor, PA | 97061-542 | |
| Invitrogen EVOS FL Auto Imaging System | Thermo Fisher Scientific Waltham, MA | AMAFD1000 | or any other fluorescence microscope |
| Protein assay Bradford solution | Bio-Rad, Hercules, CA | 5000001 | |
| SpectraMax M2 Microplate Reader | Molecular Devices, Radnor, PA | 89429-532 | or any other fluorescence microplate reader |
Referências
- Birben, E., et al. Oxidative stress and antioxidant defense. World Allergy Organization Journal. 5 (1), 9-19 (2012).
- Kim, G. H., et al. The Role of Oxidative Stress in Neurodegenerative Diseases. Experimental Neurobiology. 24 (4), 325-340 (2015).
- Sullivan, L. B., Chandel, N. S. Mitochondrial reactive oxygen species and cancer. Cancer & Metabolism. 2, 17 (2014).
- Formentini, L., et al. Mitochondrial ROS Production Protects the Intestine from Inflammation through Functional M2 Macrophage Polarization. Cell Reports. 19 (6), 1202-1213 (2017).
- Rakotoarisoa, M., et al. Curcumin- and Fish Oil-Loaded Spongosome and Cubosome Nanoparticles with Neuroprotective Potential against H2O2-Induced Oxidative Stress in Differentiated Human SH-SY5Y Cells. ACS Omega. 4 (2), 3061-3073 (2019).
- Mateen, S., et al. Increased Reactive Oxygen Species Formation and Oxidative Stress in Rheumatoid Arthritis. PLoS One. 11 (4), (2016).
- Kim, H., et al. The interaction of Hemin and Sestrin2 modulates oxidative stress and colon tumor growth. Toxicology and Applied Pharmacology. 374, 77-85 (2019).
- Wang, S. H., et al. Sotetsuflavone inhibits proliferation and induces apoptosis of A549 cells through ROS-mediated mitochondrial-dependent pathway. BMC Complementary and Alternative Medicine. 18, 235 (2018).
- Kruger, N. J., Walker, J. M. The Bradford Method For Protein Quantitation. The Protein Protocols Handbook. , 17-24 (2009).
- Tetz, L. M., et al. Troubleshooting the dichlorofluorescein assay to avoid artifacts in measurement of toxicant-stimulated cellular production of reactive oxidant species. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 67 (2), 56-60 (2013).
- Rong, L., et al. Hydrogen peroxide detection with high specificity in living cells and inflamed tissues. Regenerative Biomaterials. 3 (4), 217-222 (2016).
- Liu, L. Z., et al. Quantitative detection of hydroxyl radical generated in quartz powder/phosphate buffer solution system by fluorescence spectrophotometry. Guang Pu Xue Yu Guang Pu Fen Xi. 34 (7), 1886-1889 (2014).
