Summary

慢性緑膿菌創傷感染の遅延接種モデル

Published: February 20, 2020
doi:

Summary

我々は、免疫担当マウスにおける慢性創傷感染を発生させる遅延接種プロトコルを記述する。

Abstract

緑膿菌(P.エルギノーサ)は、特に糖尿病患者および入院患者における慢性創傷感染の設定において、ヒトの健康および疾患に対する関連性を高める主要な院内感染体である。創傷病因の調査とこの病原体に対する新しい治療法の開発を支援するために、慢性感染モデルが緊急に必要とされている。ここでは、完全厚切除傷の24時間後に遅延接種を使用するプロトコルについて説明する。この時点で存在する暫定的な創傷マトリックスの感染は、迅速なクリアランスまたは感染の普及のいずれか、代わりに異物の移植や免疫抑制を必要とせずに7-10日間持続する慢性感染症を確立します。このプロトコルは、ヒトにおける術後感染の典型的な一時的な経過を模倣する。発光P.アルギノーサ株(PAO1:lux)の使用は、P.アルギノーザ創傷感染に対する細菌負担の定量的な毎日の評価を可能にする。この新しいモデルは、細菌病原体の調査および慢性P.緑菌創傷感染に対する新しい治療法の開発に有用なツールである可能性がある。

Introduction

緑膿菌(P.エルギノーサ)は、ヒトの健康と病気との関連性が高まるグラム陰性の棒状の細菌である。これは、特に免疫不全患者1、2における創傷感染を伴う、無ソコミアル設定における広範な罹患率および死亡率を担う。この病原体の多剤耐性株の出現は、P.アルギノーサ病原性、P.アルギノーサ系抗生物質耐性のメカニズム、およびこの致命的な感染症の予防と治療のための新しい方法に寄与する要因の調査のためのさらなる刺激を提供している3。したがって、これらの研究問題を調査するためのツールとしての慢性創傷感染の動物モデルの必要性はかつてないほど高まっています。

残念なことに、P. エルギノーザ感染の多くの動物モデルは、敗血症による感染症の急速な分解能または急速な減少をシミュレートする傾向があります4,5,これは、これらの感染症のしばしば慢性的な性質を適切にシミュレートしません。この欠点に対処するために、一部のモデルは、寒天ビーズ、シリコーンインプラント、またはアルギン酸ゲル6、7、8などの異物の移植を利用する。他のモデルは、高度な年齢、肥満、または糖尿病のために免疫不全であるマウスを使用し、またはシクロホスファミド誘発性好中球減少症9、10、11、12などの薬理学的手段を介して使用する。しかし、異物や免疫が損なわれた宿主の使用は、局所的な炎症過程を変化させる可能性が高く、それ以外の場合は正常な免疫系を有する宿主における慢性創傷感染に関与する病態生理学の理解を得ることは困難である。

切除後の細菌による接種の遅延を伴うマウスにおけるP.アルギノーザ創傷感染の慢性モデルを開発した。接種の遅れにより、細菌の負担を少なくとも7日間まで評価する実験が可能になります。このモデルは、P.緑菌慢性感染症の病因と新しい治療法の両方を調査するための新しい機会を開きます。

Protocol

ここに記載されているすべての方法は、スタンフォード大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。 1. 細菌の作製と増殖 研究者の機関的なバイオセーフティ委員会および動物使用委員会のガイドラインに従って、BSL-2の予防措置を講じ、P.エルギノーサおよび動物とすべての作業を行う。P. eeruginosa(マウス接種を含む) に関…

Representative Results

luxABCDEレポーターシステム(PAO1:lux)をコードするプラスミドを有するPAO1の発光株を用いて、マウスに切除創を行い、これらの創傷をプランクトンP.エルギノーサ24時間経過後に接種し、経時の細菌負担を測定した(図1および図2)。撮像光学系を用いて得られた代表的な画像は、このモデルが検出可能な発光をもたらすこ?…

Discussion

我々は、新しい遅延接種P.アルギノーザ創傷感染モデルを開発した。切除傷後24時間まで細菌による接種を遅らせるという戦略は、1週間の時間枠にわたって創傷感染の評価を可能にする。P. eeruginosaの発光株を用いることによって、感染経過過程を通して感染進行を追跡することが可能である。他のP.緑口症感染モデルと比較して感染の長いコースは、宿主と病原体の相互?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

pUT-Tn5-EM7-lux-Km1発光構築ベクトルは、J.ハーディからの優雅な贈り物でした。回路図はBioRender.comで作成されました。私たちは、創傷感染モデルに関する彼らのアドバイスのためにG.ガートナーの研究室に感謝します。また、スタンフォード・イン・ビボ・イメージングイノベーションセンターのT・ドイルの技術的専門知識に感謝します。この作品は、R21AI133370、R21AI133240、R01AI12492093の助成金によってサポートされ、スタンフォードSPARK、フォーク医学研究信託、嚢胞性線維症財団(CFF)からP.L.B.C.R.Dへの助成金はT32AI007520によってサポートされました。ガビラン・スタンフォード大学大学院理工学研究科とルベール・ストリアー・バイオ-Xスタンフォード学際大学院フェローシップがJ.M.S.を支援しました。

Materials

0.9% Sodium Chloride injection Hospira 2484457
18 G x 1 sterile needle BD 305195
25 G x 1 1/5 sterile needle BD 305127
Alcohol swab BD 326895
Aura Imaging Software Spectral Instruments Imaging n/a
Betadine Purdue Frederick Company 19-065534
Buprenorphine SR LAB Zoopharm n/a
C57BL/6J male mice The Jackson Laboratory 000664
Disposable biopsy punch, 6mm Integra 33-36
Fine scissors – Tungsten Carbide Fine Science Tools 14568-09
Glass Bead Dry Sterilizer Harvard Apparatus 61-0183
Granulated Agar Fisher BioReagents BP9744
Heating Pad Milliard 804879481218
Insulin syringe with 28 G needle BD 329461
Lago X Imaging System Spectral Instruments Imaging n/a
LB broth Fisher BioReagents BP1426
Leur-Lok 1 mL syringe BD 309628
Mini Arco Animal Trimmer Wahl Professional 919152
Nair Hair Removal Lotion with Baby Oil Church and Dwight n/a Available at any pharmacy
Octagon Forceps Fine Science Tools 11041-08
Petri dish Falcon 351029
Phosphate Buffered Saline (PBS) 1x Corning 21-040-CV
Press and Seal Cling Wrap Glad n/a
SafetyGlide Insulin syringe with 30 G needle BD 305934
Safetyglide Insulin syringe, 1/2 mL, 30 G x 5/16 TW BD 305934
Scale Ohaus Scout Pro SP202
Supplical Nutritional Supplement Henry Schein Animal Health 29908
Tegaderm, 6 cm x 7 cm 3M 1624W

Referências

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Citar este artigo
de Vries, C. R., Sweere, J. M., Ishak, H., Sunkari, V., Bach, M. S., Liu, D., Manasherob, R., Bollyky, P. L. A Delayed Inoculation Model of Chronic Pseudomonas aeruginosa Wound Infection. J. Vis. Exp. (156), e60599, doi:10.3791/60599 (2020).

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