Summary

كفاءه التمايز العصبي باستخدام ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

Published: January 18, 2020
doi:

Summary

المعروض هنا هو بروتوكول لتوليد ثقافة خليه واحده من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية والتمايز اللاحقة في خلايا السلف العصبية. البروتوكول بسيط وقوي وقابل للتطوير ومناسب للكشف عن المخدرات وتطبيقات الطب التجديدي.

Abstract

التفريق في المختبر من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) قد حولت القدرة علي دراسة التنمية البشرية علي المستويين البيولوجي والجزيئي وتوفير الخلايا لاستخدامها في التطبيقات التجديدية. النهج القياسية للثقافة hESC باستخدام ثقافة نوع مستعمره للحفاظ علي Hesc غير متمايزة والجسم الجنيني (EB) وتشكيل الوردة للتمييز في طبقات جرثوميه مختلفه غير فعاله وتستغرق وقتا طويلا. المقدمة هنا هو أسلوب ثقافة خليه واحده باستخدام hESCs بدلا من ثقافة من نوع مستعمره. هذا الأسلوب يسمح الحفاظ علي السمات المميزة لل hESCs غير متمايزة ، بما في ذلك التعبير عن علامات Hescs علي مستويات مماثله لنوع مستعمره hESCs. الاضافه إلى ذلك ، يقدم البروتوكول طريقه فعاله للجيل الخلايا العصبية (المجلس الوطني لنواب الشعب) من نوع خليه واحده hESCs التي تنتج NPCs في غضون أسبوع 1. هذه الخلايا تعبر كثيرا عن الجينات علامة المجلس الوطني ويمكن التفريق في أنواع مختلفه من الخلايا العصبية ، بما في ذلك الخلايا العصبية الدوبامين و astrocytes. هذا النظام الثقافة خليه واحده لل hESCs سيكون مفيدا في التحقيق في أليات الجزيئية لهذه العمليات ، ودراسات لبعض الامراض ، وشاشات اكتشاف المخدرات.

Introduction

الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (hESCs) لديها القدرة علي التفريق في الطبقات الجرثومية الاوليه الثلاث ، والتي تفرق بعد ذلك إلى مختلف السلالات خلايا السلف متعددة القوي. هذه السلالات تؤدي فيما بعد إلى جميع أنواع الخلايا في جسم الإنسان. وقد حولت نظم الثقافة في المختبر القدرة علي دراسة تطور الاجنه البشرية واستخدمت كاداه قيمه للحصول علي رؤى جديده حول كيفيه تنظيم هذه العمليات علي المستويين البيولوجي والجزيئي. المثل ، فان دراسات الخلايا الجذعية مستحث المستحثة (iPSCs) المتولدة من أعاده برمجه الخلايا الجسدية المعزولة عن المرضي البشريين توفر رؤى جديده للامراض المختلفة. الاضافه إلى ذلك ، يمكن للبروجنتور والخلايا المتمايزة المستمدة من hescs ان تكون مفيده للبحوث التي تنطوي علي العلاج بالخلايا الجذعية وفحص المخدرات1،2،3،4.

يمكن ان يكون مستحثا hESCs للتمييز في خلايا السلف العصبية (NPCs) ، والتي هي خلايا متعددة الإمكانات مع قدره واسعه التجديد الذاتي. فيما بعد, هذا خلايا يستطيع كنت ميزت داخل خليه عصبيه, [استروستس], و [اوليجوندروسايتس]5,6. كما تقدم NPCs نظاما خلويا للدراسات المختبرية لبيولوجيا النمو العصبي والامراض العصبية المختلفة. ومع ذلك ، فان أساليب الثقافة نوع مستعمره الحالية التي تنطوي علي hescs وتمايزها في npcs غير فعاله وغالبا ما تنطوي علي الزراعة وكذلك الجسم الجنيني (EB) وتشكيل الوردة5،7،8،9. وتظهر هذه البروتوكولات معدلات بقاء اقل وتمايزا عفويا وتستغرق وقتا أطول.

المعروض هنا هو نظام ثقافة محسنه وقويه التي هي قابله للتطوير بسهوله ويستخدم عاليه الكثافة خليه واحده ثقافة نوع من hESCs10. وساهم ادراج مثبطات روه-كيناز (روك) في تعزيز كفاءه البقاء علي قيد الحياة بشكل كبير اثناء ثقافة الخلية الواحدة من النوع hesc10و11و12و13و14. في هذا النظام الثقافي ، يمكن الحفاظ علي الhescs بسهوله وتوسيعها. الاضافه إلى ذلك ، يقدم البروتوكول طريقه فعاله لتوليد npcs من ثقافة نوع خليه واحده من hescs ، الذي يسمح لإنتاج npcs نقيه للغاية. تثبيط BMP/tgfβ/اكتيسين مسارات الإشارات مع مثبطات ألك بكفاءة للحث علي التمايز من نوع واحد من الخلايا hescs في npcs15،16، والتي يمكن ان يسببها بعد ذلك للتمييز في السلالات العصبية وظيفية ، مثل الخلايا العصبية الدوبامين و astrocytes

وباختصار ، فان بروتوكول ثقافة نوع خليه واحده باستخدام hESCs يقدم نموذجا جذابا لدراسة التفريق بين هذه الخلايا في مختلف السلالات ، بما في ذلك NPCs. هذا البروتوكول هو قابل للتطوير بسهوله ، التالي مناسبه لتوليد خلايا للبحوث التي تنطوي علي العلاج التجديدي وفحص المخدرات.

Protocol

1. اعداد الطبقة السفلية المؤهلة لغشاء القبو-لوحات مغلفه الذوبان ببطء في مصفوفة غشاء الطابق السفلي المؤهلة hESC (انظر جدول المواد) الحل في 4 درجه مئوية لمده لا تقل عن 2-3 h أو بين عشيه وضحيها لتجنب تشكيل هلام. لاعداد الطابق السفلي غشاء مصفوفة المغلفة لوحات ، وتمييع مصفوفة في DME…

Representative Results

المعروض هنا هو بروتوكول محسن للحفاظ علي وتوسيع ثقافة نوع خليه واحده من hESCs وتمايزها كفاءه في خلايا السلف العصبية ، والتي تميز في وقت لاحق إلى مختلف السلالات العصبية المصب ، بما في ذلك الخلايا العصبية والاستروسيتيه. تظهر الصور المتباينة للمرحلة التمثيلية شكل الخلية في خطوات…

Discussion

ومن المعايير الهامه لفحص المخدرات والعلاج بالخلايا الجذعية الطرق القابلة للتطوير والكفاءة للتفريق بين الhescs والسلالات المختلفة وتوليد اعداد كافيه من الخلايا المتمايزة. وقد نشرت مختلف طرق تمرير خليه واحده, في الخلايا التي يتم استزراعها في وجود مثبطات الصخور أو غيرها من الجزيئات الصغيرة ?…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر الدكتور كارل د. بورتنر (NIEHS) علي مساعدته في تحليل النظام. وقد حظي هذا البحث بدعم برنامج البحوث داخل المعهد الوطني للعلوم الصحية البيئية ، والمعاهد الوطنية للصحة ، Z01-101585 إلى AMJ.

Materials

35 mm m-dishes ibidi 81156 Cell culture dish
6-well plates Corning 3516
Accutase Innovative Cell Technologies AT104-500 Cell detachment solution
Activin A R&D system 338-AC-050
Ascorbic Acid Sigma Aldrich A4403
B27 supplement Thermo Fisher 17504044
B27 supplement (-Vit A) Thermo Fisher 12587010
BDNF Applied Biological Materials Z100065
bFGF Peprotech 100-18C
Centrifuge DAMON/ICE 428-6759
CO2 incubator Thermo Fisher 4110
Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) Corning 354277 Basement membrane matrix (used for most of the protocol here)
Cryostor CS 10 Stemcell Technologies 7930 Cell freezing solution
Dispase Stemcell Technologies 7923
DMEM Thermo Fisher 10569-010
DMEM/F12 Thermo Fisher 10565-018
Dorsomorphin Tocris 3093
EGF Peprotech AF-100-16A
Fetal Bovine Serum Fisher Scientific SH3007003HI
FGF8 Applied Biological Materials Z101705
GDNF Applied Biological Materials Z101057
Geltrex matrix Thermo Fisher A1569601 Basement membrane matrix
GlutaMax Thermo Fisher 35050061 Glutamine supplement, 100X
H9 (WA09) human embryonic stem cell line WiCell WA09
Heregulin b-1 Peprotech 100-3
IGF Peprotech 100-11
Knockout DMEM Thermo Fisher 10829018
Knockout Serum Replacement Thermo Fisher 10828028
Laminin Sigma Aldrich L2020
mTeSR1 Stemcell Technologies 85850 hESC culture medium
N2 supplement Thermo Fisher 17502001
NEAA Thermo Fisher 11140050
Neurobasal Thermo Fisher 21103049
Poly-L-ornithine Sigma Aldrich P3655
ROCK inhibitor Tocris 1254
SB431542 Tocris 1614
SHH Applied Biological Materials Z200617
Stemdiff Neural Progenitor medium Stemcell Technologies 5833 NPC expansion medium

Referências

  1. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  2. Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
  3. Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
  4. Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
  5. Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
  6. Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
  7. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  8. International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
  9. Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
  10. Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
  11. Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
  12. Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
  13. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  14. Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
  15. Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
  16. Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
  17. Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
  18. Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
  19. Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
  20. Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
  21. Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
  22. Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
  23. Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
  24. Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
  25. Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
  26. Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Biologia do Desenvolvimento. 313 (1), 107-117 (2008).

Play Video

Citar este artigo
Jeon, K., Park, K., Jetten, A. M. Efficient Neural Differentiation using Single-Cell Culture of Human Embryonic Stem Cells. J. Vis. Exp. (155), e60571, doi:10.3791/60571 (2020).

View Video