Effektiv neural differensiering bruker single-Cell kultur av Human embryonale stamceller
Summary
Presentert her er en protokoll for generering av en enkelt cellekultur av menneskelig embryonale stamceller og deres påfølgende differensiering inn nevrale stamceller. Protokollen er enkel, robust, skalerbar, og egnet for narkotika screening og regenererende medisin applikasjoner.
Abstract
In vitro differensiering av menneskelige embryonale stamceller (hESCs) har forvandlet evnen til å studere menneskelig utvikling på både biologiske og molekylære nivåer og gitt celler for bruk i regenererende applikasjoner. Standard tilnærminger for hESC kultur bruker koloni type kultur for å opprettholde udifferensierte hESCs og embryoid kropp (EB) og rosett formasjon for differensiering i ulike bakterie lag er ineffektiv og tidkrevende. Presentert her er en enkelt cellekultur metoden bruker hESCs stedet for en koloni-type kultur. Denne metoden tillater vedlikehold av de karakteristiske trekk ved udifferensierte hESCs, inkludert uttrykk for hESC markører på nivåer som kan sammenlignes med koloni type hESCs. I tillegg presenterer protokollen en effektiv metode for neural stamfar celle (NPC) generasjon fra én celle type hESCs som produserer NPCer innen 1 uke. Disse cellene svært uttrykker flere NPC markør gener og kan differensiere til ulike nevrale celletyper, inkludert dopaminerg neurons og astrocytter. Denne single-cellekultur system for hESCs vil være nyttig i å undersøke den molekylære mekanismer av disse prosessene, studier av visse sykdommer, og stoffet funnet skjermer.
Introduction
Human embryonale stamceller (hESCs) har potensial til å differensiere til de tre primære bakterie lag, som deretter differensiere til ulike Multipotent Stamcelle linjene. Disse linjene senere gi opphav til alle celletyper i menneskekroppen. In vitro hESC kultur systemer har forvandlet evnen til å studere menneskets embryoutvikling og har fungert som et verdifullt verktøy for å få ny innsikt i hvordan disse prosessene er regulert på biologiske og molekylære nivåer. Tilsvarende studier av indusert Pluripotent stamceller (iPSCs) generert fra omprogrammering somatiske celler isolert fra menneskelige pasienter gi romanen innsikt i ulike sykdommer. I tillegg kan stamfar og differensiert celler avledet fra hESCs være nyttig for forskning som involverer stilk cellen terapi og Drug screening1,2,3,4.
hESCs kan bli overtalt til å differensiere til nevrale stamceller (NPCer), som er multipotential celler med en omfattende selv-fornyelse kapasitet. Deretter kan disse cellene være differensiert i neurons, astrocytter, og oligodendrocytes5,6. NPCer tilbyr også et mobil system for in vitro studier av neurodevelopmental biologi og ulike nevrologiske sykdommer. Men dagens koloni type kultur metoder som involverer hESCs og deres differensiering i NPCer er ineffektiv og ofte innebære coculture samt embryoid Body (EB) og rosett formasjon5,7,8,9. Disse protokollene viser lavere overlevelses rater og spontan differensiering og er mer tidkrevende.
Presentert her er en forbedret og robust kultur system som er lett skalerbar og bruker høy tetthet enkelt celle type kultur hESCs10. Inkluderingen av Roh-kinase (rock)-hemmer bidro til betydelig forbedret overlevelses effektivitet under enkelt celle type kulturen i hESC10,11,12,13,14. I dette kultur systemet kan hESCs enkelt vedlikeholdes og utvides. I tillegg presenterer protokollen en effektiv metode for å generere NPCer fra enkelt celle type kultur hESCs, som tillater produksjon av svært rene NPCer. hemming av BMP/TGFβ/activin signalering trasé med ALK hemmere effektivt indusere differensiering av enkelt celle type hESCs inn NPCer15,16, som deretter kan bli indusert å differensiere til funksjonell nevrale linjene, som dopaminerg neurons og astrocytter.
I sammendraget, den single-Cell type kultur protokoll ved hjelp hESCs tilbyr en attraktiv modell for å studere differensiering av disse cellene i ulike linjene, inkludert NPCer. Denne protokollen er lett skalerbar og derfor egnet til å generere celler for forskning som involverer regenererende terapi og narkotika screening.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skalerbare og effektive metoder for differensiering av hESCs i ulike linjene og generering av tilstrekkelig antall differensiert celler er viktige kriterier for narkotika screening og stilk cellen terapi. Ulike single-celle passerer metoder har blitt publisert, der cellene er kultivert i nærvær av rock inhibitor eller andre små molekyler for å forbedre overlevelse, men de endelige produktene av disse kultur metoder er koloni type hESCs17,18,<sup cl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Carl D. Bortner (NIEHS) for hans hjelp med FACS analyse. Denne forskningen ble støttet av intramural Research program ved National Institute of Environmental Health Sciences, National Institutes of Health, Z01-ES-101585 til AMJ.
Materials
| 35 mm m-dishes | ibidi | 81156 | Cell culture dish |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104-500 | Cell detachment solution |
| Activin A | R&D system | 338-AC-050 | |
| Ascorbic Acid | Sigma Aldrich | A4403 | |
| B27 supplement | Thermo Fisher | 17504044 | |
| B27 supplement (-Vit A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
| BDNF | Applied Biological Materials | Z100065 | |
| bFGF | Peprotech | 100-18C | |
| Centrifuge | DAMON/ICE | 428-6759 | |
| CO2 incubator | Thermo Fisher | 4110 | |
| Corning hESC-qulified Matrix (Magrigel) | Corning | 354277 | Basement membrane matrix (used for most of the protocol here) |
| Cryostor CS 10 | Stemcell Technologies | 7930 | Cell freezing solution |
| Dispase | Stemcell Technologies | 7923 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 10569-010 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher | 10565-018 | |
| Dorsomorphin | Tocris | 3093 | |
| EGF | Peprotech | AF-100-16A | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003HI | |
| FGF8 | Applied Biological Materials | Z101705 | |
| GDNF | Applied Biological Materials | Z101057 | |
| Geltrex matrix | Thermo Fisher | A1569601 | Basement membrane matrix |
| GlutaMax | Thermo Fisher | 35050061 | Glutamine supplement, 100X |
| H9 (WA09) human embryonic stem cell line | WiCell | WA09 | |
| Heregulin b-1 | Peprotech | 100-3 | |
| IGF | Peprotech | 100-11 | |
| Knockout DMEM | Thermo Fisher | 10829018 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Fisher | 10828028 | |
| Laminin | Sigma Aldrich | L2020 | |
| mTeSR1 | Stemcell Technologies | 85850 | hESC culture medium |
| N2 supplement | Thermo Fisher | 17502001 | |
| NEAA | Thermo Fisher | 11140050 | |
| Neurobasal | Thermo Fisher | 21103049 | |
| Poly-L-ornithine | Sigma Aldrich | P3655 | |
| ROCK inhibitor | Tocris | 1254 | |
| SB431542 | Tocris | 1614 | |
| SHH | Applied Biological Materials | Z200617 | |
| Stemdiff Neural Progenitor medium | Stemcell Technologies | 5833 | NPC expansion medium |
Referências
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Rosler, E. S., et al. Long-term culture of human embryonic stem cells in feeder-free conditions. Developmental Dynamics. 229 (2), 259-274 (2004).
- Mallon, B. S., Park, K. Y., Chen, K. G., Hamilton, R. S., McKay, R. D. Toward xeno-free culture of human embryonic stem cells. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 38 (7), 1063-1075 (2006).
- Hoffman, L. M., Carpenter, M. K. Characterization and culture of human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (6), 699-708 (2005).
- Yan, Y., et al. Efficient and rapid derivation of primitive neural stem cells and generation of brain subtype neurons from human pluripotent stem cells. Stem Cells Translational Medicine. 2 (11), 862-870 (2013).
- Goncalves, J. T., Schafer, S. T., Gage, F. H. Adult Neurogenesis in the Hippocampus: From Stem Cells to Behavior. Cell. 167 (4), 897-914 (2016).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
- International Stem Cell Initiative. Characterization of human embryonic stem cell lines by the International Stem Cell Initiative. Nature Biotechnology. 25 (7), 803-816 (2007).
- Hartung, O., Huo, H., Daley, G. Q., Schlaeger, T. M. Clump passaging and expansion of human embryonic and induced pluripotent stem cells on mouse embryonic fibroblast feeder cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 14 (1), 10 (2010).
- Chen, K. G., et al. Non-colony type monolayer culture of human embryonic stem cells. Stem Cell Research. 9 (3), 237-248 (2012).
- Chen, G., Hou, Z., Gulbranson, D. R., Thomson, J. A. Actin-myosin contractility is responsible for the reduced viability of dissociated human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 240-248 (2010).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2009).
- Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
- Pakzad, M., et al. Presence of a ROCK inhibitor in extracellular matrix supports more undifferentiated growth of feeder-free human embryonic and induced pluripotent stem cells upon passaging. Stem Cell Reviews and Reports. 6 (1), 96-107 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nature Biotechnology. 27 (3), 275-280 (2009).
- Jeon, K., et al. GLIS3 Transcriptionally Activates WNT Genes to Promote Differentiation of Human Embryonic Stem Cells into Posterior Neural Progenitors. Stem Cells. 37 (2), 202-215 (2019).
- Emre, N., et al. The ROCK inhibitor Y-27632 improves recovery of human embryonic stem cells after fluorescence-activated cell sorting with multiple cell surface markers. PLoS ONE. 5 (8), e12148 (2010).
- Hanna, J., et al. Human embryonic stem cells with biological and epigenetic characteristics similar to those of mouse ESCs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (20), 9222-9227 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Tsutsui, H., et al. An optimized small molecule inhibitor cocktail supports long-term maintenance of human embryonic stem cells. Nature Communications. 2, 167 (2011).
- Xu, Y., et al. Revealing a core signaling regulatory mechanism for pluripotent stem cell survival and self-renewal by small molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (18), 8129-8134 (2010).
- Ungrin, M. D., Joshi, C., Nica, A., Bauwens, C., Zandstra, P. W. Reproducible, ultra high-throughput formation of multicellular organization from single cell suspension-derived human embryonic stem cell aggregates. PLoS ONE. 3 (2), e1565 (2008).
- Kim, D. S., et al. Highly pure and expandable PSA-NCAM-positive neural precursors from human ESC and iPSC-derived neural rosettes. PLoS ONE. 7 (7), e39715 (2012).
- Sun, Y., Hu, J., Zhou, L., Pollard, S. M., Smith, A. Interplay between FGF2 and BMP controls the self-renewal, dormancy and differentiation of rat neural stem cells. Journal of Cell Science. 124 (Pt 11), 1867-1877 (2011).
- Zhou, J. M., Chu, J. X., Chen, X. J. An improved protocol that induces human embryonic stem cells to differentiate into neural cells in vitro. Cell Biology International. 32 (1), 80-85 (2008).
- Smith, J. R., et al. Inhibition of Activin/Nodal signaling promotes specification of human embryonic stem cells into neuroectoderm. Biologia do Desenvolvimento. 313 (1), 107-117 (2008).
