Stereologische Abschätzung der cholinergen Faserlänge im Nukleus Basalis von Meynert des Maushirns
Summary
Die neuronale Faserlänge innerhalb einer dreidimensionalen Struktur einer Hirnregion ist ein zuverlässiger Parameter, um spezifische neuronale strukturelle Integrität oder Degeneration zu quantifizieren. Dieser Artikel beschreibt eine stereologische Quantifizierungsmethode zur Messung der cholinergen Faserlänge innerhalb des Kernbasalis von Meynert bei Mäusen als Beispiel.
Abstract
Die Länge von cholinergen oder anderen neuronalen Axonen in verschiedenen Hirnregionen korreliert oft mit der spezifischen Funktion der Region. Die Stereologie ist eine nützliche Methode, um neuronale Profile verschiedener Gehirnstrukturen zu quantifizieren. Hier stellen wir ein softwarebasiertes Stereologie-Protokoll zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im Kern basalis von Meynert (NBM) des Basalvorhirns zur Verfügung. Die Methode verwendet eine Raumkugelsonde für Längenschätzungen. Die cholinerge Fasern werden durch Cholin-Acetyltransferase (ChAT) Immunfärbung mit dem Meerrettich peroxidase-Diaminobenzidin (HRP-DAB) Detektionssystem visualisiert. Das Färbeprotokoll gilt auch für die Faser- und Zellzahlenschätzung in verschiedenen Hirnregionen mit Stereologie-Software. Das stereologische Protokoll kann zur Abschätzung von linearen Profilen wie chollinoceptiven Fasern, dopaminergen/katecholaminergen Fasern, serotonergen Fasern, Astrozytenprozessen oder sogar Gefäßprofilen verwendet werden.
Introduction
Quantitative Schätzungen der Länge und/oder Dichte von Nervenfasern im Gehirn sind wichtige Parameter neuropathologischer Studien. Die Länge der cholinergen, dopaminergen und serotonergen Axone in verschiedenen Hirnregionen sind oft mit den spezifischen Funktionen der Region korreliert. Da die Verteilung dieser Axone im Allgemeinen heterogen ist, wird die designbasierte Stereologie verwendet, um Verzerrungen während der Probenahme zu vermeiden. Die Raumkugelsonde der Stereologie wurde entwickelt, um effiziente und zuverlässige Messungen von linienähnlichen Strukturen wie neuronalen Fasern in einer Region von Interesse zu bieten1. Die Sonde bildet eine virtuelle Kugel, die systematisch im Gewebe aufgezwungen wird, um Linienschnitte mit der Oberfläche der Sonde zu messen. Da es unmöglich ist, Kugelsonden zur Analyse in das Gewebe zu legen, bietet die kommerziell erhältliche Software eine virtuelle dreidimensionale (3D) Kugel, die im Grunde eine Reihe konzentrischer Kreise mit verschiedenen Durchmessern ist, die die Oberfläche der Kugelsonde darstellen.
Selektive cholinerge Neurodegeneration ist eines der konsistenten Merkmale der Alzheimer-Krankheit (AD)2,3,4. Dysfunktionale cholinerge Übertragung gilt als ein ursächlichen Faktor für kognitive Nk. Cholinerge Dysfunktion ist auch bei vielen anderen psychischen Störungen wie Parkinson, Sucht, und Schizophrenie offensichtlich. Verschiedene Aspekte der cholinergen Neurodegeneration werden in Tiermodellen untersucht (z.B. Reduktion in Acetylcholin5, ChAT-Protein6, cholinerge Faser-Neurodegeneration in der Nähe von Amyloid-Plaques6, und Abnahme der cholinergen Fasern und synaptischen Varikosen7,8). Es wird angenommen, dass die Faserdegeneration früher als der neuronale Verlust stattfindet, da cholinerge neuronaler Verlust nicht immer in Studien beobachtet wird. Die meisten cholinergen Neuronen befinden sich im Basalvorhirn und im Hirnstamm, und ihre Axone projizieren auf verschiedene Hirnregionen wie die Kortizes und den Hippocampus. NBM befindet sich im Basalvorhirn und ist einer der am häufigsten betroffenen Hirnbereiche in AD.
Die Fraktionatormethode der Stereologie basiert auf einer systematischen Stichprobenerhebung eines Gewebes auf mehreren Ebenen. Section Sampling Fraction (SSF) ist die nicht computergestützte systematische Probenahme von Abschnitten für die Fraktionatormethode der Stereologie. Flächenstichprobenfraktion (ASF) ist die Fraktionierung eines Bereichs der Interessenregion in diesem Abschnitt. Die Dickeentnahmefraktion (TSF) ist die Fraktionierung der Dicke eines Abschnitts. Die Raumkugelsonde ermöglicht es uns, Profile von Interesse in einer 3D-Kugel an fraktionierten Stellen zu quantifizieren. Hier verwenden wir eine Raumkugelsonde zur Schätzung der Gesamtlänge cholinerger Fasern im NBM des Maushirns, um die Abläufe zu veranschaulichen. Das aktuelle Protokoll enthält Details zur Gewebeverarbeitung, Probenahmemethoden für die Stereologie, immunhistochemische Färbung mit dem ChAT-Antikörper und unvoreingenommene Stereologie zur Schätzung der cholinergen Faserlänge und Faserdichte im NBM des Maushirns.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier zeigen wir eine Methode zur Abschätzung der Dichte cholinerger Fasern in der NBM mit einer Raumkugelsonde ( Kugel). Diese Sonde schätzt die gesamte Faserlänge in der Region von Interesse. Die Gesamtlänge kann durch das Volumen der Region geteilt werden, um die Faserdichte zu erhalten. Um das Volumen der Region zu schätzen, wurde die Cavalieri-Punktzählungsmethode verwendet. Die Cavalieri-Punktzählungsmethode ist ein unvoreingenommener und effizienter Schätzer eines 3D-Referenzvolumens für jede Region. Die M…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch Stipendien an W.Z.S. vom Medical Research and Development Service, Department of Veterans Affairs (Merit Review 1I01 BX001067-01A2), die Alzheimer es Association (NPSPAD-11-202149) und Ressourcen aus dem Midwest Biomedical unterstützt. Forschungsstiftung.
Materials
| ABC kit | Vector Laboratories | PK6100 | |
| Anti-ChAT Antibody | Millipore, MA, USA | AB144P | |
| Bovine anti-goat IgG-B | Santacruz Biotechnology | SC-2347 | |
| Bovine Serum, Adult | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | B9433 | |
| Cryostat | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | ||
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | D5652 | |
| Ethylene Glycol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 324558 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | G2025 | |
| Hydrogen Peroxide | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | H1009 | |
| Immpact-DAB kit | Vector Laboratories | SK4105 | Enhanced DAB peroxidase substrate solution |
| Ketamine | Westward Pharmaceuticals, NJ, USA | 0143-9509-01 | |
| Microscope | Lieca Microsystems, Buffalo Grove, IL, USA | AF6000 | Equipped with motorized stage and IMI-tech color digital camera |
| Optimum cutting temperature (O.C.T.) embedding medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 62550-12 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | P6148 | |
| Permount mounting medium | Electron Microscopy Sciences, PA, USA | 17986-01 | |
| Stereologer Software | Stereology Resource Center, Inc. St. Petersburg, FL, USA | Stereologer2000 | Installed on a Dell Desktop computer. |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787 | |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T1503 | Tris base |
| Trizma hydrochloride | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T5941 | Tris hydrochloride |
| Xylazine | Bayer, Leverkusen, Germany | Rompun | |
| Xylenes, Histological grade | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | 534056 |
Referências
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