Summary

在重复性扩散创伤性脑损伤小鼠模型中诱导创伤后癫痫

Published: February 10, 2020
doi:

Summary

此系统协议描述了重复性轻度创伤性脑损伤后创伤后癫痫的新动物模型。第一部分详细介绍了使用修改后的降重模型进行创伤性脑损伤诱导的步骤。第二部分对单通道和多通道脑电图数据采集系统的手术方法进行了说明。

Abstract

创伤性脑损伤(TBI)是后天性癫痫的主要原因。TBI 可导致焦点或扩散性脑损伤。焦点损伤是直接机械力的结果,有时穿透颅骨,在脑组织中产生直接病变。这些在脑成像过程中可见,作为有挫伤、撕裂和出血的区域。焦点病变导致神经元死亡和胶质疤痕的形成,并且存在于所有发生 TBI 的 20% -25% 的人的中。然而,在大多数TBI病例中,损伤是由加速减速力和随后的组织剪切引起的,导致非焦、漫反射损伤。TBI患者的亚群在几个月或几年的潜伏期后继续发展创伤后癫痫(PTE)。目前,无法预测哪些患者会患上PTE,PTE患者的癫痫发作难以控制,需要进一步研究。直到最近,该领域仅限于两个经过验证的自发创伤后发作的动物/啮齿动物模型,两者都出现大的焦点病变,皮层和有时皮下结构组织大量丧失。与这些方法相反,确定使用改良的降重模型诱导的漫射TBI足以启动自发性惊厥和非抽搐发作的发展,即使在没有焦点病变或组织损失的情况下也是如此。与获得性创伤后癫痫的人类患者类似,该模型在发作前呈现损伤后的潜伏期。在该协议中,将为社区提供创伤后癫痫的新模型,详细说明如何诱导扩散性非病变TBI,然后持续进行持续的长期视脑动物监测,持续几个月。该协议将详细说明动物处理、重量下降程序、两个采集系统的电极放置,以及手术、术后监控和数据采集过程中遇到的频繁挑战。

Introduction

每年,TBI 影响全世界大约 6000 万人。受影响的个人患癫痫的风险较高,癫痫发作后数年可能显现出来。虽然严重的TBI与较高的癫痫风险有关,即使是轻微的TBI也会增加个人患癫痫的几率1,2,3,4。所有 TI 都可以分类为焦距、漫反射或两者的组合。扩散性脑损伤,存在于许多(如果不是全部)的TbIs中,是由于加速减速和旋转力导致不同密度的脑组织相互剪切的结果。根据定义,扩散损伤只发生在轻度/脑震荡非穿透性脑损伤中,其中在计算机断层扫描5中看不到脑损伤。

目前,在管理患有或有发生创伤后癫痫(PTE)风险的患者方面,存在两个关键问题。第一,一旦PTE出现,癫痫发作对现有的抗癫痫药物(AEDs)有抗药性6。其次,AED在预防癫痫发作方面同样无效,没有有效的替代治疗方法。为了解决这个缺陷,并找到更好的治疗目标和治疗候选,有必要在PTE6的根部探索新的细胞和分子机制。

创伤后癫痫的一个突出特征是初始创伤事件与自发、无端、复发性发作之间的潜伏期。在这个时间窗口内发生的事件是研究人员的自然焦点,因为这个时间窗口可能允许治疗和预防PTE完全。动物模型最常用于这项研究,因为它们提供了几个截然不同的好处,其中最重要的是,在如此长的时间跨度内,持续监测人类患者既不切实际又昂贵。此外,只有在动物模型中才能探索癫痫发生根源的细胞和分子机制。

与在TBI后通过不太相关的生理相关手段(如通过化学惊厥或急性、慢性或点燃引起电刺激)诱导癫痫发作的模型比较,具有自发创伤后癫痫的动物模型更可取。自发的创伤后癫痫发作模型测试TBI如何改变导致癫痫发作的健康大脑网络。在TBI后使用额外刺激的研究评估接触TBI如何降低癫痫发作阈值并影响癫痫发作的易感性。具有化学或电刺激诱导发作的动物模型的优点是测试耐火性对AED的具体机制以及现有和新型AED的功效。然而,这些数据对人类的相关性和翻译程度可能不明确7,原因如下:1) 癫痫发作机制可能与仅由TBI引起的发作机制不同;1) 癫痫发作机制可能不同于TBI单独诱发的机制。2) 并非所有这些模型导致自发性发作7;3) 由抽搐剂本身产生的病变,其传递所需的管状,或通过刺激电极放置在深度结构(例如,海马或杏仁核)已经可能导致增加的癫痫易感性,甚至海马癫痫表场电位7。此外,一些抽搐剂(即开酸)产生直接的海马病变和硬化症,这在扩散TBI后并不常见。

直到最近,只有两种创伤后癫痫的动物模型存在:受控皮质撞击(CCI,焦)或流体打击损伤(FPI,焦和扩散)8。这两种模型导致大的焦点病变,同时组织损失,出血,和胶质瘤在啮齿动物8。这些模型模仿由大焦点病变引起的创伤后癫痫。最近的一项研究表明,重复(3倍)扩散TBI足以在小鼠中发展自发性发作和癫痫,即使没有焦点病变9,增加了第三个啮齿动物PTE模型与确认的自发性复发性发作。这种新模型模仿由漫射TBI引起的细胞和分子变化,更好地代表轻度脑震荡TBI人群。在此模型中,癫痫发作前三周或以上的潜伏期以及晚期、自发性、复发性发作的出现,有助于调查创伤后癫痫发生的根本原因,测试预防方法的有效性和癫痫发作后的新治疗候选者,并有可能开发创伤后癫痫发生的生物标志物,因为大约一半的动物会发展成创伤后癫痫。

研究创伤后癫痫的动物模型的选择取决于科学问题、所调查的脑损伤类型以及将用什么工具来确定潜在的细胞和分子机制。最终,任何创伤后癫痫模型都必须证明TBI后自发性癫痫发作的出现和TBI动物的初期潜伏期,因为并非所有发生TBI的患者都会发展成癫痫。为此,该协议使用同时视频采集的脑电图(EEG)。了解数据采集硬件和方法背后的技术方面对于准确解释数据至关重要。关键硬件方面包括记录系统的类型、电极类型(螺钉或导线引线)及其材料、同步视频采集(作为 EEG 系统的一部分或第三方)以及计算机系统的属性。根据研究目标、感兴趣的脑电图事件、进一步分析方法和数据存储的可持续性,在任何类型的系统中设置适当的采集参数势在必行。最后,必须考虑电极配置(蒙太奇)的方法,因为每种方法都有优缺点,会影响数据解释。

该协议详细介绍了如何使用经过改进的Marmarou降压模型10,11诱导扩散损伤,导致小鼠自发的、无端的、复发性发作,描述了使用单极、双极或混合蒙太奇获得单通道和多通道连续和同步视频EEG的手术方法。

Protocol

本议定书中描述的所有动物程序均按照弗吉尼亚理工大学机构动物护理和使用委员会(IACUC)执行,并符合美国国家卫生研究院的《实验室动物护理和使用指南》。. 1. 动物处理协议 注:本协议旨在将从供应商订购的动物在抵达后安排到设施,并规定它们由实验者处理。这通过减少压力和焦虑来改善动物福祉,并简化某些需要处理动物的程序,包括诱导TBI?…

Representative Results

此处概述的协议描述了使用重复扩散 TBI 的小鼠模型(图 1)隔离诱导漫射损伤的方法(例如,在没有焦点病变的情况下)。图 1A描述了用于在此模型中诱导 TBI 的降重装置及其组件(图1A、a1_a5)以及过程中的关键步骤(图 1B,b1_b5)。 该模型的特?…

Discussion

与 CCI 和 FPI 模型诱导焦力或焦点和漫反射损伤的组合不同,本协议中描述的重复扩散 TBI 模型允许在没有焦点脑损伤的情况下诱导扩散损伤,并且不需要头皮或颅开口和相关炎症。该模型中没有颅切除术的一个附加好处是,它不仅允许植入用于慢性连续脑电图记录的电极,而且还可以创建一个薄颅骨窗口,用于在动物之前、紧接之后、之后、再重复几天、几周甚至几个月,如Sandra和Robel 2019<sup clas…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

这项工作得到了R01 NS105807/NS/NINDS NIH HHS/美国和CURE的支持,其依据是美国陆军医学研究和物资司令部(国防部)通过”心理健康和创伤性脑损伤研究计划”获得的第1号奖励。W81XWH-15-2-0069。伊万·祖伊德霍克对手稿进行校对,非常感谢他。

Materials

0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8209 0.10 inch long stainless steel
0.10" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8403 0.10 inch long with pre-soldered wire lead
0.12" screw Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8212 0.12 inch long stainless steel
1EEG headmount Invitro1 (subsidiary of Plastics One), VA, USA MS333/8-A/SPC 3 individually Teflon-insulated platinum iridium wire electrodes (twisted or untwisted, 0.005 inch diameter) extending below threaded plastic pedestal
2EEG/1EMG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8201 2EEG/1EMG channels
3% hydrogen peroxide Pharmacy
3EEG headmount Pinnacle Technology Inc., KS, USA 8235-SM-C custom 6-Pin Connector for 3EEG channels
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
Buprenorphine Par Pharmaceuticals, Cos. Inc., Spring Valley, NY, USA 060969
C57BL/6 mice Harlan/Envigo Laboratories Inc male, 12-16 weeks old
C57BL/6 mice The Jackson Laboratory male, 12-16 weeks old
Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357 NOTE: this drug is added during weight drop only if stereotactic electrode implantation will be performed on the same day
Chlorhexidine antiseptic Pharmacy
Dental cement and solvent kit Stoelting Co., USA 51459
Drill Foredom HP4-917
Drill bit Meisinger USA, LLC, USA HM1-005-HP 0.5 mm, Round, 1/4, Steel
Dry sterilizer Cellpoint Scientific, USA Germinator 500
EEG System 1 Biopac Systems, CA, USA
EEG System 2 Pinnacle Technology Inc., KS, USA
Ethanol ≥70% VWR, USA 71001-652 KOPTEC USP, Biotechnology Grade (140 Proof)
Eye ointment Pro Labs Ltd, USA Puralube Vet Ointment Sterile Ocular Lubricant available in general online stores and pharmacies
Fluriso liquid for inhalation anesthesia MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Hair removal product Church & Dwight Co., Inc., USA Nair cream
Isoflurane MWI Veterinary Supply Co., USA 502017
Povidone-iodine surgical solution Purdue Products, USA 004677 Betadine
Rimadyl/Carprofen Zoetis Services LLC, Parsippany, NJ, USA 026357
Solder Harware store
Soldering iron Weller, USA WP35 ST7 tip, 0.8mm
Stainless steel disc Custom made
Sterile cotton swabs
Sterile gauze pads Fisher Scientific, USA 22362178
Sterile poly-lined absorbent towels pads Cardinal Health, USA 3520
Tissue adhesive 3M Animal Care Products, USA 1469SB

Referências

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Citar este artigo
Shandra, O., Robel, S. Inducing Post-Traumatic Epilepsy in a Mouse Model of Repetitive Diffuse Traumatic Brain Injury. J. Vis. Exp. (156), e60360, doi:10.3791/60360 (2020).

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