Purkinje Zell Überleben in organotypischen Zerebellar Slice Kulturen

In-vitro-Modellierung ist ein wesentliches Werkzeug in der biomedizinischen Forschung. Es ermöglicht den Forschern, spezifische Mechanismen in eingeschränkten Zelltypen oder in isolierten Systemen/Organen zu untersuchen und streng zu kontrollieren. Organotypische Scheibenkultur ist eine weit verbreitete In-vitro-Technik, vor allem im Bereich der Neurowissenschaften¹. Die Methode wurde zuerst von Gähwiler etabliert, der Gehirnscheiben mit der Rollenrohrtechnik²kultivierte, und später modifiziert von Yamamoto et al., der die Verwendung einer mikroporösen Membran einführte, um kortikale Scheibenkulturen durchzuführen³. Im Vergleich zu primären Zellkulturen bieten organotypische Scheibenkulturen den Vorteil, die Zytoarchitektur des Gewebes sowie einheimische Zell-Zell-Verbindungen in der Ebene des Gewebeabschnitts zu erhalten.

Organotypische Scheiben wurden aus vielen Teilen des zentralen Nervensystems kultiviert, wie der Hippocampus⁴, Cortex⁵, Striatum⁶, Kleinhirn^4,7, und Rückenmark^8,9, unter anderem. Sie haben sich als ein leistungsfähiges Werkzeug in Drogen-Entdeckungsstudien¹⁰. Die Auswirkungen neuroaktiver Moleküle können auf vielfältige Weise bewertet werden: Überleben und Neurodegeneration mit Immunostaining- und Biochemie-Assays, neuronale Schaltungsbildung oder Unterbrechung enthoben mit Elektrophysiologie und Live-Imaging.

Das Ziel dieser Arbeit ist es, eine einfache Methode zu beschreiben, um organotypische Kleinhirn-Scheibenkultur durchzuführen, die bekanntermaßen ein relevantes Modell ist, um die Entwicklung von Kleinhirn in vitro nachzuahmen. Insbesondere konzentrierten wir uns auf die Untersuchung des Purkinje-Zellentwicklungstodes. In vivo, Purkinje-Zellen unterziehen Apoptose während der ersten postnatalen Woche, Höhepunkt am postnatalen Tag 3 (P3)¹¹. Das gleiche Muster wird in der Kleinhirnscheibenkultur beobachtet, wobei Purkinje-Neuronen durch Apoptose sterben, wenn Kleinhirn von Tieren zwischen P1 und P8 genommen wird, mit einem Spitzenwert bei P3^4,12. Die Verwendung der organotypischen Kleinhirnscheibenkulturen hat es ermöglicht, mehrere neuroprotektive Moleküle^7,13, sowie das Verständnis eines Teils der Mechanismen, die an diesem programmierten Zelltod beteiligt sind, zu identifizieren^14,15,16. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das auf der Untersuchung von Stoppini et al.¹⁷ im Hippocampus basiert und von Dusart et al. an Kleinhirn angepasst wurde.⁴ Es beinhaltet eine schnelle Zerlegung und Zerkleinerung der postnatalen Kleinhirn; Kultur auf einen Zellkultureinsatz schneiden, der eine mikroporöse Membran mit oder ohne neuroprotektive Behandlung enthält; und Immunfluoreszenzfärbung zur Beurteilung des neuronalen Überlebens.