Visualización y análisis del transporte intracelular de organelos y otros Cargos en astrocitos

Los astrocitos son las células más abundantes en el sistema nervioso central adulto, donde realizan funciones únicas de desarrollo y homeostáticos¹. Los astrocitos modulan el desarrollo sináptico a través del contacto directo con terminales pre y postsinápticos como parte de la sinapsis tripartito, que contiene receptores de neurotransmisores, transportadores y moléculas de adhesión celular que facilitan la formación de sinapsis y comunicación neurona-astrocito². Además, los astrocitos controlan activamente la transmisión sináptica y previenen la excitotoxicidad neuronal eliminando rápidamente los neurotransmisores excitatorios de la hendidura sináptica, los neurotransmisores de reciclaje, y participando en la poda sináptica^{3 , 4 , 5 , 6}. Para permitir estas funciones altamente interactivas, los astrocitos se comunican entre sí, con otras células gliales, y con las neuronas a través de proteínas de membrana especializadas, incluyendo moléculas de adhesión celular, acuporinas, canales ióniales, transportadores de neurotransmisores, y moléculas de unión de brecha. Los astrocitos cambian activamente los niveles superficiales de estas proteínas en respuesta a las fluctuaciones en su entorno intra y extracelular⁷. Además, los cambios en los niveles y la distribución de las mitocondrias, las gotas lipídicas y los orgánulos dedegradadores y reciclados modulan el suministro de energía, la disponibilidad de metabolitos y los procesos de limpieza celular que son esenciales para la función astrocitos y Supervivencia.

Los cambios dinámicos en el tráfico y posicionamiento de proteínas de membrana y orgánulos en astrocitos seven facilitados por la función concertada de las proteínas motoras y adaptadores que promueven la motilidad de carga 8,^9. Del mismo modo, los niveles superficiales de proteínas de membrana se modulan a través de eventos de internalización y reciclaje¹⁰. Estas cargas se transportan a través de una intrincada red de actina, microtúbulos y, posiblemente, filamentos intermedios^delas pistas 8. Los estudios basados en la tinción de inmunofluorescencia de la proteína de unión final 1 (EB1), que se acumula en los extremos del microtúbulo más, sugieren que en los haces de los astrocitos de microtúbulos irradian desde el perinúcleo y extienden su extremo más hacia el periferia¹¹. Sin embargo, todavía falta un examen exhaustivo de la organización y polaridad de los microtúbulos y otros elementos citoesqueléticos mediante imágenes de células vivas. Mientras que muchos de los mecanismos subyacentes a la dinámica de los orgánulos y proteínas de membrana se han estudiado ampliamente en las neuronas y otros tipos de células, la motilidad de carga en los astrocitos es menos bien entendida. La mayor parte de nuestro conocimiento actual sobre los cambios en la distribución de proteínas y orgánulos en los astrocitos se basa en el etiquetado tradicional basado en anticuerpos de preparación fija, que impide el examen espacial y temporal preciso de la dinámica de carga^{7, 12}.

Aquí, describimos un método para etiquetar proteínas de membrana y orgánulos para imágenes en vivo en cultivos primarios de astrocitos de ratón de alta pureza. Usando este protocolo, proporcionamos ejemplos en los que rastreamos la localización dinámica de proteínas de membrana etiquetadas con proteína fluorescente verde (GFP) en astrocitos transinfectados, incluyendo la proteína de unión gap connexin 43 (Cx43-GFP) y el aminoácido excitatorio transportador 1 (EAAT1-GFP). También describimos el uso de una sonda acidotrópica fluorescente para visualizar orgánulos ácidos y seguir su dinámica de tráfico en astrocitos vivos. Por último, demostramos cómo analizar los datos de lapso de tiempo para extraer y evaluar los parámetros de transporte para cargas individuales.