Visualisering en analyse van intracellulair transport van organellen en andere Cargo's in astrocyten

Astrocyten zijn de meest voorkomende cellen in het centrale zenuwstelsel van de volwassene, waar ze unieke ontwikkelings-en homeostatische functies uitvoeren¹. Astrocyten moduleren synaptische ontwikkeling door direct contact met pre-en postsynaptisch terminals als onderdeel van de Tri-partite Synapse, die bevat neurotransmitter receptoren, transporters, en celadhesie moleculen die Synapse vorming vergemakkelijken en neuron-astrocyten communicatie². Bovendien, astrocyten actief controle synaptische transmissie en voorkomen neuronale excitotoxicity door het snel verwijderen van excitatory neurotransmitters uit de synaptische gespleten, recycling neurotransmitters, en deelnemen aan synaptische snoeien^{3 , 4 , 5 , 6}. om deze zeer interactieve functies mogelijk te maken, communiceren astrocyten onderling, met andere gliacellen en met neuronen via gespecialiseerde membraan proteïnen, waaronder celadhesie moleculen, aquaporinen, ionenkanalen, neurotransmitter transporteurs, en gap junction moleculen. Astrocyten veranderen actief de oppervlakte niveaus van deze eiwitten in reactie op schommelingen in hun intra-en extracellulaire omgeving⁷. Bovendien, veranderingen in de niveaus en de verdeling van de mitochondriën, lipide druppeltjes, en degradatieve en recycling organellen moduleren energietoevoer, metaboliet beschikbaarheid, en cellulaire clearing processen die essentieel zijn voor de functie van de astrocyten en Overleving.

De dynamische veranderingen in membraan proteïne en organel-handel en positionering in astrocyten worden vergemakkelijkt door de gezamenlijke functie van motor eiwitten en adapters die de beweeglijkheid van de lading bevorderen^8,9. Evenzo worden de oppervlakte niveaus van membraan proteïnen gemoduleerd door middel van internalisatie en recycling evenementen¹⁰. Deze cargo’s worden getransporteerd via een ingewikkeld netwerk van actin, microtubuli, en eventueel tussenliggende filamenten tracks⁸. Studies op basis van immunofluorescentie kleuring van end-binding proteïne 1 (EB1), die zich ophogt bij de groeiende microtubulus plus uiteinden, suggereren dat in astrocyten bundels van microtubuli uit de perinucleons uitstralen en hun plus einde uitbreiden naar de periferie¹¹. Echter, een uitgebreid onderzoek van de organisatie en de polariteit van microtubuli en andere cytoskelet elementen met behulp van Live-celbeeldvorming ontbreekt nog. Hoewel veel van de mechanismen die ten grondslag liggen aan de dynamiek van organellen en membraan eiwitten uitvoerig zijn bestudeerd in neuronen en andere celtypen, is de beweeglijkheid van de lading in astrocyten minder goed begrepen. De meeste van onze huidige kennis over veranderingen in de eiwit-en organel verdeling in astrocyten is gebaseerd op traditionele etikettering van vaste stoffen op basis van antilichamen, die het precieze ruimtelijke en temporele onderzoek van Cargo Dynamics⁷uitsluit^{, 12}.

Hier beschrijven we een methode om membraan eiwitten en organellen te labelen voor Live beeldvorming in primaire muis astrocyten culturen. Met behulp van dit protocol, bieden we voorbeelden waarin we de dynamische lokalisatie van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde membraan eiwitten in getransfunteerde astrocyten, waaronder de gap junction Protein connexin 43 (Cx43-GFP) en het excitatory aminozuur Transporter 1 (EAAT1-GFP). We beschrijven ook het gebruik van een fluorescerende acidotrope sonde om zure organellen te visualiseren en de dynamiek van hun handel in levende astrocyten te volgen. Ten slotte laten we zien hoe u de timelapse-gegevens analyseert om transport parameters voor individuele ladingen te extraheren en te evalueren.