Generazione di ascia chimerica con arti aploidi mutanti attraverso l'innesto embrionale
Summary
Questo obiettivo di questo protocollo è quello di produrre axolotl chimerici con arti anteriori aploidi derivati dal tessuto donatore mutageno Cas9 utilizzando tecniche di innesto di tessuti embrionali.
Abstract
Un insieme crescente di tecniche e risorse genetiche consente ai ricercatori di sondare le origini molecolari della capacità di alcune specie di salamandre, come gli axolotl, di rigenerare interi arti da adulti. Qui, illustremo le tecniche utilizzate per generare axolotl chimerici con arti anteriori aploidi aploidi con anammi aploidi con anamne aploidi con anamne mutagenizzati di Cas9 che possono essere utilizzati per esplorare la funzione genica e la fedeltà della rigenerazione degli arti. Uniamo diverse tecniche embrionali e genetiche, tra cui la generazione di aploidi tramite attivazione in vitro, la mutagenesi CRISPR/Cas9 e l’innesto di tessuto in un unico protocollo per produrre un sistema unico per lo screening genetico aploide in un organismo modello di rigenerazione. Questa strategia riduce il numero di animali, lo spazio e il tempo necessari per l’analisi funzionale dei geni nella rigenerazione degli arti. Ciò consente anche di sapiere le funzioni specifiche della rigenerazione dei geni che possono essere necessarie per altri processi essenziali, come l’organogenesi, la morfogenesi dei tessuti e altri processi embrionali essenziali. Il metodo qui descritto è una piattaforma unica per condurre lo screening genetico degli aploidi in un sistema modello di vertebrato.
Introduction
Storicamente, l’innesto di tessuto embrionale negli anfibi è stata una tecnica importante per esplorare i meccanismi fondamentali della biologia dello sviluppo e della rigenerazione. L’axolotl, una specie di salamandra, possiede un’impressionante capacità di rigenerare i tessuti e strutture complesse come arti e organi dopo lesioni o amputazioni. Allo stesso modo impressionante, possono ricevere, senza rigetto, innesti tissutali da altri individui a stadi embrionali, giovani e adulti1,2,3. Regioni di embrioni che producono intere strutture come arti, code, occhi e teste, e tessuti più specifici, come neuroectodermi e somiti, possono essere innestati tra embrioni per produrre animali chimerici1,2,4,5,6. Per quasi un secolo, studi su tali animali chimerici hanno fornito informazioni cruciali sulla rigenerazione, la differenziazione dei tessuti, il controllo delle dimensioni e il patterning1,7,8.
Nell’ultimo decennio, numerosi studi trascrizionali sui tessuti rigeneranti hanno prodotto approfondimenti sui programmi genetici alla base della rigenerazione della salamandra9,10,11,12,13. Questi studi hanno aggiunto un elenco in espansione di geni candidati che, ad oggi, sono in gran parte caratterizzati nel contesto della rigenerazione. Tecniche mirate di mutagenesi, come CRISPR/Cas, ora permettono lo studio di tali geni, e tali approcci genetici sono notevolmente facilitati dal recente sequenziamento e assemblaggio del grande genoma axolotl14,15,16.
Abbiamo cercato di sviluppare tecniche che associavano la biologia dello sviluppo classico alla nuova tecnologia genetica allo scopo di sezionare i meccanismi di rigenerazione. I metodi per la generazione di embrioni aploidi di axolotle e altre salamandre sono stati stabiliti per decenni17. Mentre queste tecniche sono state a lungo notate come vantaggi delle salamandre come organismi modellogenetico 18, pochi studi genetici successivi hanno incorporato animali aploidi. Usiamo l’attivazione in vitro nell’axolotl per produrre embrioni aploidi che fungono da donatori di tessuti per l’innesto19. Utilizzando embrioni che trasportano marcatori genetici fluorescenti, abbiamo ideato metodi affidabili per generare arti derivati quasi interamente dai tessuti donatrici (Figura 1A). Combinando queste due tecniche, abbiamo aggirato la letale embrionale tardiva associata all’aploidia, consentendo la produzione di arti aploidi completamente sviluppati e innestati (Figura 1B, Figura 1Be Figura 2).
Conducendo la mutagenesi mediata DA CRISPR/Cas in embrioni aploidi prima dell’innesto per creare axolotli chimerici con arti aploidi mutanti, possiamo studiare la funzione genica specificamente nel contesto dello sviluppo e della rigenerazione degli arti. Ciò consente il salvataggio di arti da fenotipi mutanti potenzialmente embrionali-letali. Mentre la microiniezione CRISPR/Cas può generare animali altamente mutanti, tali animali sono tipicamente altamente mosaici, con un certo grado di ritenzione di alleli wildtype e una varietà di mutazioni distinte nei siti mirati14,20. La mutagenesi a base di CRISPR nelle cellule aploidi aumenta la penetrazione delle mutazioni della perdita di funzione di singolo allele, in quanto non possono essere mascherate da alleli wildtype conservati. Per questo motivo, lo screening basato su CRISPR nelle linee cellulari aploidi viene sempre più utilizzato per studiare la base genetica di molti processi cellulari21,22,23. Combinando il tracciamento del lignaggio basato su CRISPR con i nostri protocolli di innesto di boccioli aploidi, l’approccio qui descritto può servire come piattaforma per schermi genetici aploidi in animali viventi20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono alcuni passaggi critici nel nostro protocollo per la generazione di chimere aploidi-diploidi che il tecnico operativo dovrebbe prendere in considerazione per risultati di innesto coerenti.
La ragione più probabile per cui la generazione di aploidi fallisce è dovuta a cattive condizioni di attivazione in vitro. Le quantità adeguate di spermatozoi motile devono essere utilizzate per attivare le uova. Per prolungare la motilità, i campioni di sperma devono sempre essere mantenuti a 4 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare Katherine Roberts per la sua cura della colonia axolotl. I finanziamenti per questo lavoro sono stati erogati dal Connecticut Innovations Regenerative Medicine Research Fund (15RMA-YALE-09 e 15-RMB-YALE-01) e dall’Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health and Human Development (Individual Postdoctoral Fellowship F32HD086942).
Materials
| #55 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11295-1 | Only use Dumostar material (can be autoclaved) |
| Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2942-20ML | 20 mL |
| Antibiotic-Antimycotic 100x | Thermo Fisher | 15240062 | |
| Ciprofloxacin | Sigma Aldrich | 17850-5G-F | |
| Ficoll 400 (polysucrose 400) | bioworld | 40600032-3 | Ficoll 400 |
| Gentamicin | Sigma Aldrich | G1914-250MG | |
| Heating/Cooling Incubator | RevSci | RS-IF-233 | |
| Human Chorionic Gonadotropin | Merk | Chorulon | |
| Megascript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher | AM1334 | 40 reactions |
| Miroscope Cooling Stage | Brook Industries | Custom | Custom |
| NLS Cas9 Protein | PNAbio | CP01-200 | 4 vials of 50 µg protein each |
| Plasmocin | Invivogen | ant-mpt-1 | Treatment level |
| Recipes | |||
| 1.0x Marc's modified Ringer's solution (MMR) | 0.1 M NaCl, 2 mM KCl, 1 mM MgSO4, 2 mM CaCl2, 0.1 mM EDTA, 5 mM HEPES (pH 7.8), ph 7.4 | ||
| 40% Holtfreter's solution | 20 mM NaCl, 0.2 mM KCl, 0.8 mM NaHCO3, 0.2 mM CaCl2, 4 mM MgSO4, pH to 7.4 |
Referências
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