Summary

Caractérisation des agrégats de protéines individuels par nanospectroscopie infrarouge et microscopie de force atomique

Published: September 12, 2019
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Summary

Nous décrivons l’application de la nanospectroscopie infrarouge et de la microscopie à haute résolution pour visualiser le processus d’auto-assemblage des protéines dans les agrégats oligomériques et les fibrilles amyloïdes, qui est étroitement associée à l’entrée et au développement d’un large éventail de troubles neurodégénératifs humains.

Abstract

Le phénomène de l’épandage et de l’agrégation de protéines induits en protéines entraîne la formation d’agrégats protéiques très hétérogènes, qui sont associés à des maladies neurodégénératives comme la maladie d’Alzheimer et la maladie de Parkinson. En particulier les agrégats de faible poids moléculaire, oligomères amyloïdes, ont été montrés pour posséder des propriétés cytotoxiques génériques et sont impliqués comme neurotoxines dans de nombreuses formes de démence. Nous illustrons l’utilisation de méthodes basées sur la microscopie de la force atomique (AFM) pour répondre à la tâche difficile de caractériser les propriétés morphologiques, structurelles et chimiques de ces agrégats, qui sont difficiles à étudier à l’aide de structures conventionnelles méthodes biophysiques en vrac en raison de leur hétérogénéité et de leur nature transitoire. Les approches de microscopie des sondes de balayage sont maintenant capables d’étudier la morphologie des agrégats amyloïdes avec une résolution sous-nanométrique. Nous montrons ici que la nanospectroscopie infrarouge (IR), qui exploite simultanément la haute résolution de l’AFM et la puissance de reconnaissance chimique de la spectroscopie IR, peut aller plus loin et permettre la caractérisation des propriétés structurelles des individus protéines, et offrent ainsi un aperçu des mécanismes d’agrégation. Puisque l’approche que nous décrivons peut également être appliquée aux investigations des interactions des assemblages de protéine avec de petites molécules et anticorps, elle peut fournir l’information fondamentale pour développer de nouveaux composés thérapeutiques pour diagnostiquer ou traiter neurodegenerative.

Introduction

Plus de 40 millions de personnes dans le monde sont actuellement touchées par des troubles neurodégénératifs, tels que la maladie d’Alzheimer (MA)1 et la maladie de Parkinson (PD)2 maladies. Plus généralement, plus de cinquante pathologies sont associées au niveau moléculaire à la méplication et à l’agrégation des protéines, un processus qui conduit à la prolifération d’agrégats insolubles de protéines fibrillaires, connus sous le nom de dépôts amyloïdes3, 4. Les origines moléculaires de la neurodégénérescence et ses liens avec les changements conformationnels protéiques des protéines conduisant à la formation d’amyloïdes, cependant, restent incertaines, en grande partie en raison du niveau élevé d’hétérogénéité, de nature transitoire et de nanoéchelle dimensions des agrégats pathologiques4,5.

Les études très réussies des structures protéiques au cours des dernières décennies ont été largement basées sur l’utilisation de méthodes en vrac, y compris la cristallographie aux rayons X, la microscopie cryo-électronique et la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire5, 6 Annonces , 7 Annonces , 8 Annonces , 9. Dans cette catégorie de techniques, la spectroscopie infrarouge (IR) est apparue comme un outil d’analyse sensible pour démêler les propriétés chimiques des systèmes biologiques tels que les protéines8. Les méthodes d’IR permettent la quantification des changements structurels secondaires et quaternaires de protéine pendant leur malplier et agrégation. En outre, afin de déchiffrer davantage au niveau microscopique les détails mécanistes impliqués dans les paysages complexes d’énergie libre de protéines au cours de leur agrégation, une avancée majeure a été le développement d’outils de cinétique chimique pour s’étendre à la complexité voies d’auto-assemblage, y compris la formation de fibrilles amyloïdes5,6,7,10,11,12. Cependant, les méthodes spectroscopiques en vrac ne fournissent que des informations moyennes sur l’ensemble hétérogène d’espèces présentes en solution ou impliquées dans des étapes microscopiques spécifiques, rendant ainsi l’étude des propriétés biophysiques des individus espèces agrégées défiant au niveau nanométrique13,14.

Plusieurs techniques de microscopie avec la capacité de fonctionner sur des échelles plus petites que la limite de diffraction de la lumière ont émergé au cours des dernières décennies. Cette classe de méthodes comprend la microscopie électronique (EM) et la microscopie par force atomique (AFM). Alors que la microscopie électronique à balayage (SEM) et la microscopie électronique de transmission (TEM) fournissent des images bidimensionnelles (2D) d’un spécimen, l’AFM est apparue au cours des dernières décennies comme une technique puissante et polyvalente pour étudier les morphologies tridimensionnelles (3D), ainsi que les propriétés nanomécaniques d’un échantillon avec la résolution de sous-nanomètre13,14,15,16,17,18,19, 20 Ans, états-unis , 21 Ans, états-unis , 22 Ans , 23 Ans, états-unis , 24 Ans, états-unis , 25 Annonces , 26 Annonces , 27. La raison d’être de l’étude de l’agrégation des protéines par l’intermédiaire de l’AFM est que cette approche permet d’étudier la morphologie des espèces individuelles présentes dans la solution13,14,16, 17,19,20,21,25,27,28,29,30, 31,32,33,34,35,36,37. En particulier, en surveillant l’échantillon en fonction du temps, l’AFM permet d’enquêter sur l’évolution de la morphologie de l’espèce au sein de l’échantillon, ce qui permet de suivre et de visualiser les voies de la formation amyloïde23, 25,38,39,40,41,42. En outre, l’AFM permet de quantifier les paramètres structurels tels que les hauteurs transversales et les longueurs des espèces individuelles présentes dans la solution13,19,30,31 ,32,33,34,35,36,37,40,43, 44 Ans, en est à qui , 45 Annonces , 46 Annonces , 47 Annonces , 48. Cependant, l’étude d’une seule propriété biophysique, comme la morphologie, n’est souvent pas suffisante pour étudier des systèmes biologiques hétérogènes et complexes. Les méthodes d’imagerie AFM, SEM ou TEM à elles seules ne révèlent pas facilement les propriétés chimiques des espèces hétérogènes d’agrégats amyloïdes à l’échelle nanométrique.

Une avancée majeure pour l’analyse d’échantillons biologiques hétérogènes à cette échelle a été faite récemment avec le développement et l’application dans le domaine de l’agrégation de protéines de la nanospectroscopie infrarouge (AFM-IR)24,26, 38,42,49,50,51,52. Cette méthode innovante exploite la combinaison de la résolution spatiale de l’AFM (1 à 10 nm) avec la puissance d’analyse chimique de l’IR. La technique AFM-IR est basée sur la mesure de l’effet de résonance induit par photothermale entraîné par un laser IR, et sur la mesure de l’expansion thermique de l’échantillon à l’étude par la pointe de l’AFM. L’échantillon peut être éclairé par le laser IR directement à partir du haut ou du bas en toute réflexion interne, de la même manière que dans la spectroscopie infrarouge conventionnelle24,42,52,53 . Le laser IR peut être pulsé avec des fréquences typiques de l’ordre de centaines de kilohertz (1-1000 kHz) et réglé sur une large portée spectrale, généralement entre 1000-3300 cm-1. Bien que la source laser couvre une superficie de 30 m de diamètre, la résolution spatiale de la technique AFM-IR est déterminée nominalement par le diamètre de la pointe AFM, qui détecte l’expansion thermique locale du système. L’AFM-IR est bien adapté pour étudier les échantillons biologiques parce que le signal IR est proportionnel à leur épaisseur jusqu’à 1,5 m, et les spectres IR qui en résultent sont généralement en accord avec les spectres de transmission FTIR correspondants13,54 ,55. Pour cette raison, les méthodes d’analyse établies en spectroscopie peuvent être facilement appliquées, telles que l’étude des changements chimiques, le changement de forme de bande et la déconvolution par deuxième analyse des dérivés52. Dans l’ensemble, en combinant la résolution spatiale de l’AFM avec la puissance de reconnaissance chimique de la spectroscopie IR, l’AFM-IR permet l’acquisition simultanée d’un large éventail de propriétés morphologiques, mécaniques et chimiques d’un échantillon à l’échelle nanométrique.

Ici, nous illustrons un protocole pour la caractérisation du processus d’agrégation de protéines qui exploite la combinaison des essais de fluorescence in vitro, de l’imagerie AFM haute résolution et de l’AFM-IR à l’échelle nanométrique. Cette approche combinée a déjà excellé dans l’étude des résultats détaillés dans l’étude des propriétés chimiques et structurelles des microgouttes individuelles formées par les agrégats protéiques, dans l’étude de la séparation de la phase des protéines liquides-liquides, et dans étudier l’hétérogénéité et les propriétés biophysiques des espèces agrégées individuelles à l’échelle nanométrique23,26,38,45,50,53, 56,57.

Protocol

1. Tests d’agrégation sur les lecteurs de plaques de fluorescence REMARQUE : Le protocole décrit ici est un exemple de la façon d’étudier l’agrégation de toute protéine ou peptide par la cinétique chimique. En particulier, il décrit un protocole optimisé pour étudier l’agrégation du peptide A-42, qui est impliqué dans l’début et la progression de la maladie d’Alzheimer58,59. Un protocole similaire peut être ajusté et adopt…

Representative Results

Un cours de temps représentatif de l’agrégation de l’A-42, tel que mesuré par l’assiduescence de ThT, est indiqué à la figure 1. Le processus d’agrégation est généralement caractérisé par une courbe sigmoïdale, où une phase de décalage est initialement observée, et est suivie d’une phase de croissance abrupte, avant que la courbe n’atteigne un plateau lorsqu’un état d’équilibre stable est atteint6,7 , <sup …

Discussion

La première étape critique de ce protocole est la préparation de protéines monomériques, comme dans le cas de la solution A-42 décrite dans les étapes 1.1 et 1.2. Il est essentiel d’initier le processus d’agrégation à partir d’une solution monomeric très pure, car la présence d’espèces oligomériques ou agrégées peut entraîner une mauvaise reproductibilité de la cinétique d’agrégation58, et induire des artefacts dans l’AFM (p. ex., les espèces fibrillaires seront évidentes aux …

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs remercient la Fondation nationale suisse pour la science (SNF) pour le soutien financier (numéro de subvention P2ELP2-162116 et P300P2-171219), le Darwin College, le programme ErasmusMD pour le soutien financier (numéro de subvention 2018-1-LT01-KA103-046719-15400-P3) et le recherche menant à ces résultats a reçu un financement du Conseil européen de la recherche dans le cadre du septième programme-cadre de l’Union européenne (7e FP/2007-2013) par l’intermédiaire de la subvention PhysProt (accord numéro 337969), de la Fondation Newman (T.P.J.K.) et de Cambridge Centre for Misfolding Diseases (C.G., M.V., et T.P.J.K.).

Materials

AFM-IR system Anasys Instruments nanoIR 2 or 3 Systems to measure thermal expansion in contact and resonance mode
Corning 96-well Half Area Black/Clear Bottom Polystyrene NBS Microplate Corning 3881
Corning Microplate Aluminium Sealing Tape Corning 6570
Double Sided Adhesive Discs AGAR Scientific AGG3347N
FLUOstar Omega BMG Labtech 415-101 Platereader
Mica Disc 10mm V1 AGAR Scientific AGF7013
Park NX10 AFM system Park Systems N/A Atomic Force Microscope
Platypus Ultra-Flat Gold Chips Platypus Technologies AU.1000.SWTSG
PPP-NCHR-10 cantilevers Park Systems PPP-NCHR-10
Protein LowBind Tubes, 2.0mL Eppendorf 30108132
Silicon gold coated cantilevers Anasys Instruments PR-EX-nIR2
SPM Specimen Discs 12mm AGAR Scientific AGF7001

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