Summary

Улучшение малых РНК-сек: Меньше предвзятости и лучшее обнаружение 2'-O-Метил РНК

Published: September 16, 2019
doi:

Summary

Мы представляем подробный небольшой протокол репарации библиотеки РНК с меньшим уклоном, чем стандартные методы и повышенной чувствительностью для 2′-O-метил РНК. Этот протокол можно соблюдать с помощью самодельных реагентов, чтобы сэкономить стоимость или с помощью комплектов для удобства.

Abstract

Изучение малых РНК (РНК) по секвенированию следующего поколения (NGS) оспаривается проблемами предвзятости при подготовке библиотеки. Несколько типов сРНК, таких как микроРНК растений (миРНК) имеют модификацию 2’O-метил (2′-OMe) на их 3′ терминал нуклеотида. Эта модификация добавляет еще одну трудность, поскольку она подавляет 3′ перевязки адаптера. Ранее мы продемонстрировали, что модифицированные версии протокола ‘TruSeq (TS)’ имеют меньшую предвзятость и улучшенное обнаружение 2′-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол ‘TS5’, который показал лучшую общую производительность. За TS5 можно следить либо с помощью самодельных реагентов, либо реагентов из комплекта TS, с одинаковой производительностью.

Introduction

Малые РНК (РНК) участвуют в контроле разнообразия биологических процессов1. Eukaryotic нормативных sRNAs, как правило, между 20 и 30 nt в размере; три основных типа: микроРНК (miRNA), piwi-взаимодействующих РНК (piRNA) и малых интерферирующих РНК (siRNA). Аномальные уровни экспрессии miRNA были вовлечены в различные заболевания2. Это подчеркивает важность миРНК в области здравоохранения и болезней и потребность в точных количественных исследовательских инструментах для выявления СРНК в целом.

Секвенирование следующего поколения (NGS) является широко используемым методом изучения сРНК. Основные преимущества NGS по сравнению с другими подходами, такими как количественные методы ПЦР или microarray (qPCR), заключаются в том, что он не нуждается в априори знания последовательностей сРНК и поэтому может быть использован для обнаружения новых РНК, и, кроме того, он страдает меньше фоновый сигнал и эффекты насыщения. Кроме того, он может обнаружить одно нуклеотидные различия и имеет более высокую пропускную мощность, чем microarrays. Тем не менее, NGS также имеет некоторые недостатки; стоимость последовательного запуска остается относительно высокой, и многоступенчатый процесс, необходимый для преобразования образца в библиотеку для секвенирования, может привести к смещениям. В типичном процессе подготовки библиотеки sRNA, 3′ адаптер сначала ligated к sRNA (часто гель-очищенной от полной РНК) используя усеченную версию RNA ligase 2 (RNL2) и preadenylated 3′ адаптер(Рисунок 1) в отсутствии ATP. Это повышает эффективность перевязки sRNA-адаптера и уменьшает образование побочных реакций, таких как циркуляризация sRNA или конкатегоризация. Впоследствии 5′ адаптер сливается с помощью РНК лигаза 1 (RNL1), а затем обратная транскрипция (RT) и pcR усиление. Все эти шаги могут ввести предвзятость3,4. Следовательно, считываемые числа могут не отражать фактические уровни экспрессии sRNA, ведущие к искусственным, зависимым от метода шаблонам выражения. Конкретные СРНК могут быть либо чрезмерно или недопредставлены в библиотеке, а сильно недопредставленные СРНк могут избежать обнаружения. Особенно сложная ситуация с растительными миРНКами, сиРНК у насекомых и растений, а также пиРНК у насекомых, нематод и млекопитающих, в которых 3′ терминальный нуклеотид имеет 2’O-метил (2′-OMe) модификацию1. Эта модификация сильно подавляет перевязку 3′ адаптера5,что делает подготовку библиотеки для этих типов РНК трудной задачей.

Предыдущая работа показала, что перевязка адаптера вводит серьезные предубеждения, из-за РНК последовательности / структурных эффектов6,7,8,9,10,11. Шаги вниз по течению перевязки адаптера, такие как обратная транскрипция и ПЦР, существенно не способствуют смещению6,11,12. Смещение лигации, вероятно, связано с тем, что молекулы адаптера с заданной последовательностью будут взаимодействовать с молекулами SRNA в реакционной смеси для формирования сгибов, что может либо привести к благоприятным или неблагоприятным конфигурациям для перевязки(рисунок 2). Данные Sorefan et al7 свидетельствуют о том, что RNL1 предпочитает один контекст, в то время как RNL2 предпочитает двойную нить для перевязки. Тот факт, что структуры совместного сгиба адаптера/sRNA определяются конкретным истектором адаптера и последовательностями sRNA, объясняет, почему конкретные sRNA чрезмерно или недопредставлены с данным набором адаптера. Важно также отметить, что в рамках серии библиотек sRNA для сопоставления следует использовать одни и те же последовательности адаптера. Действительно, ранее было отмечено, что изменение адаптеров путем введения различных последовательностей штрих-кодов изменяет профили miRNA в секвенирующих библиотеках9,13.

Рандомизация последовательностей адаптера вблизи перевязочных узлов, вероятно, уменьшает эти предубеждения. Sorefan и коллеги7 использовали адаптеры с 4 случайных нуклеотидов на их конечностях, назначенных “Высокой четкости” (HD) адаптеры, и показал, что использование этих адаптеров привести к библиотекам, которые лучше отражают истинные уровни экспрессии SRNA. Более поздние работы подтвердили эти наблюдения и показали, что рандомизированный регион не должен быть рядом с перевязочную перевязку11. Этот новый тип адаптеров был назван “MidRand” адаптеры. В совокупности эти результаты показывают, что улучшение конструкции адаптера может уменьшить предвзятость.

Вместо того, чтобы изменять адаптеры, смещение может быть подавлено путем оптимизации условий реакции. Полиэтиленгликоль (PEG), макромолекулярный скученность агент, как известно, увеличение эффективности перевязки14, было показано, значительно уменьшить предвзятость15,16. На основе этих результатов на рынке появилось несколько комплектов “низкой предвзятости”. К ним относятся комплекты, которые используют PEG в реакции перевязки, либо в сочетании с классическими адаптерами или HD адаптеры. Другие комплекты избежать перевязки в целом, и использовать 3′ полиаденилаации и шаблона переключения для 3′ и 5′ адаптер дополнение, соответственно12. В еще одной стратегии, 3′ перевязка адаптера сопровождается круговой шаг, таким образом, опуская 5′ адаптер перевязки17.

В предыдущем исследовании мы искали протокол подготовки библиотеки sRNA с наименьшими уровнями смещения и лучшим обнаружением 2′-OMe РНК12. Мы протестировали некоторые из вышеупомянутых комплектов «низкого смещения», которые имели лучшее обнаружение 2′-OMe РНК, чем стандартный протокол (TS). Удивительно, однако, при модификации (использование рандомизированных адаптеров, PEG в реакции перевязки и удаление избытка 3′ адаптера путем очистки) последний превзошел другие протоколы для обнаружения 2′-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол, основанный на протоколе TS, ‘TS5′, который имел лучшее общее обнаружение 2′-OMe РНК. Протокол можно соблюдать с помощью реагентов из комплекта ТС и одного реагента из комплекта «Nf» или, чтобы сэкономить деньги, с помощью самодельных реагентов, с одинаковой производительностью. Мы также предоставляем подробный протокол для очистки сРНК от общей РНК и подготовки предаденина 3’ адаптера.

Protocol

1. Изоляция малых РНК Извлекайте полную РНК с помощью реагентов на основе фенола или любого другого метода. Проверьте, является ли РНК хорошего качества. Предварительно запустить 15% TBE-мочевого геля (см. Таблица материалов) в течение 15 мин при 200 В. В то время как ге…

Representative Results

Критическими шагами являются изоляция небольшой рнковой доли исходного материала РНК(рисунок 3)и желаемого конечного продукта библиотеки(рисунок 4). Оба этапа включают очистку полиакриламидного геля; малая РНК выделена из 15% гелей мочевины TBE, в то время …

Discussion

Подготовка небольшой библиотеки РНК остается сложной из-за предвзятости, в основном внедряемой во время этапов перевязки адаптера. РНК с 2′-OMe модификации в их 3 ‘конец, такие как мифы растений, piRNA у насекомых, нематод и млекопитающих, и малых вмешательства РНК (siRNA) в насекомых и растений о…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа была поддержана Национальным центром научных исследований (CNRS), Французской комиссией по альтернативным энергетикам и атомной энергии (CEA) и Университетом Париж-Суд. Вся подготовка библиотеки, анализы последовательности illumina и биоинформатики для данного исследования были проведены на объекте I2BC Next-Generation Sequencing (NGS). Члены i2BC NGS объекта признаны для критического чтения рукописи и полезные предложения.

Materials

2100 Bioanalyzer Instrument  Agilent G2939BA
Acid-Phenol:Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1) ThermoFisher AM9720
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) Nex England Biolabs P0756S
Agencourt AMPure XP beads Beckman Coulter A63880
Bioanalyzer High Sensitivity DNA Kit Agilent 5067-4626
Bioanalyzer Small RNA Kit Agilent 5067-1548
Corning Costar Spin-X centrifuge tube filters Sigma Aldrich CLS8162-96EA
Dark Reader transilluminator various suppiers
HotStart PCR Kit, with dNTPs Kapa Biosystems KK2501
NEXTflex small RNA-seq V3 kit BIOO Scientific NOVA-5132-05 optional
Novex TBE gels 6% ThermoFisher EC6265BOX
Novex TBE Urea gels 15% ThermoFisher EC6885BOX
QIAquick Nucleotide Removal Kit Qiagen  28304
Qubit 4 Quantitation Starter Kit ThermoFisher Q33227
Qubit ssDNA Assay Kit ThermoFisher Q10212
RNA Gel Loading Dye (2X) ThermoFisher R0641
RNA Gel Loading Dye (2X) ThermoFisher R0641
RNase Inhibitor, Murine  Nex England Biolabs M0314S
SuperScript IV Reverse Transcriptase ThermoFisher 18090200
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain ThermoFisher S11494
T4 RNA Ligase 1 (ssRNA Ligase) Nex England Biolabs M0204S
T4 RNA Ligase 2, truncated Nex England Biolabs M0242S
TrackIt 50 bp DNA ladder ThermoFisher 10488043
TruSeq Small RNA Library Prep Kit Illumina RS-200-0012/24/36/48 optional
UltraPure Glycogen ThermoFisher 10814010
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher EI0001
XCell SureLock Mini-Cell ThermoFisher EI0001
ZR small RNA ladder Zymo Research R1090
the last two numbers correspond to the set of indexes

Referências

  1. Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nature Reviews Genetics. 10, 94-108 (2009).
  2. Chang, T. C., Mendell, J. T. microRNAs in vertebrate physiology and human disease. Annual Review of Genomics and Human Genetics. 8, 215-239 (2007).
  3. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Robb, G. B. Small RNA expression profiling by high-throughput sequencing: implications of enzymatic manipulation. Journal of Nucleic Acids. 2012, 360358 (2012).
  4. van Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental Cell Research. 322, 12-20 (2014).
  5. Munafo, D. B., Robb, G. B. Optimization of enzymatic reaction conditions for generating representative pools of cDNA from small RNA. RNA. 16, 2537-2552 (2010).
  6. Hafner, M., et al. RNA-ligase-dependent biases in miRNA representation in deep-sequenced small RNA cDNA libraries. RNA. 17, 1697-1712 (2011).
  7. Sorefan, K., et al. Reducing ligation bias of small RNAs in libraries for next generation sequencing. Silence. 3, 4 (2012).
  8. Sun, G., et al. A bias-reducing strategy in profiling small RNAs using Solexa. RNA. 17, 2256-2262 (2011).
  9. Jayaprakash, A. D., Jabado, O., Brown, B. D., Sachidanandam, R. Identification and remediation of biases in the activity of RNA ligases in small-RNA deep sequencing. Nucleic Acids Research. 39, 141 (2011).
  10. Zhuang, F., Fuchs, R. T., Sun, Z., Zheng, Y., Robb, G. B. Structural bias in T4 RNA ligase-mediated 3′-adapter ligation. Nucleic Acids Research. 40, 54 (2012).
  11. Fuchs, R. T., Sun, Z., Zhuang, F., Robb, G. B. Bias in ligation-based small RNA sequencing library construction is determined by adaptor and RNA structure. PLoS One. 10, 0126049 (2015).
  12. Dard-Dascot, C., et al. Systematic comparison of small RNA library preparation protocols for next-generation sequencing. BMC Genomics. 19, 118 (2018).
  13. Van Nieuwerburgh, F., et al. Quantitative bias in Illumina TruSeq and a novel post amplification barcoding strategy for multiplexed DNA and small RNA deep sequencing. PLoS One. 6, 26969 (2011).
  14. Harrison, B., Zimmerman, S. B. Polymer-stimulated ligation: enhanced ligation of oligo- and polynucleotides by T4 RNA ligase in polymer solutions. Nucleic Acids Research. 12, 8235-8251 (1984).
  15. Song, Y., Liu, K. J., Wang, T. H. Elimination of ligation dependent artifacts in T4 RNA ligase to achieve high efficiency and low bias microRNA capture. PLoS One. 9, 94619 (2014).
  16. Zhang, Z., Lee, J. E., Riemondy, K., Anderson, E. M., Yi, R. High-efficiency RNA cloning enables accurate quantification of miRNA expression by deep sequencing. Genome Biology. 14, 109 (2013).
  17. Barberan-Soler, S., et al. Decreasing miRNA sequencing bias using a single adapter and circularization approach. Genome Biology. 19, 105 (2018).
  18. Chen, Y. R., et al. A cost-effective method for Illumina small RNA-Seq library preparation using T4 RNA ligase 1 adenylated adapters. Plant Methods. 8, 41 (2012).
  19. Martin, M. Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet. , (2011).
  20. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biology. 10, 25 (2009).
  21. Shore, S., et al. Small RNA Library Preparation Method for Next-Generation Sequencing Using Chemical Modifications to Prevent Adapter Dimer Formation. PLoS One. 11, 0167009 (2016).

Play Video

Citar este artigo
van Dijk, E. L., Eleftheriou, E., Thermes, C. Improving Small RNA-seq: Less Bias and Better Detection of 2′-O-Methyl RNAs. J. Vis. Exp. (151), e60056, doi:10.3791/60056 (2019).

View Video