Улучшение малых РНК-сек: Меньше предвзятости и лучшее обнаружение 2'-O-Метил РНК

Малые РНК (РНК) участвуют в контроле разнообразия биологических процессов^1. Eukaryotic нормативных sRNAs, как правило, между 20 и 30 nt в размере; три основных типа: микроРНК (miRNA), piwi-взаимодействующих РНК (piRNA) и малых интерферирующих РНК (siRNA). Аномальные уровни экспрессии miRNA были вовлечены в различные заболевания². Это подчеркивает важность миРНК в области здравоохранения и болезней и потребность в точных количественных исследовательских инструментах для выявления СРНК в целом.

Секвенирование следующего поколения (NGS) является широко используемым методом изучения сРНК. Основные преимущества NGS по сравнению с другими подходами, такими как количественные методы ПЦР или microarray (qPCR), заключаются в том, что он не нуждается в априори знания последовательностей сРНК и поэтому может быть использован для обнаружения новых РНК, и, кроме того, он страдает меньше фоновый сигнал и эффекты насыщения. Кроме того, он может обнаружить одно нуклеотидные различия и имеет более высокую пропускную мощность, чем microarrays. Тем не менее, NGS также имеет некоторые недостатки; стоимость последовательного запуска остается относительно высокой, и многоступенчатый процесс, необходимый для преобразования образца в библиотеку для секвенирования, может привести к смещениям. В типичном процессе подготовки библиотеки sRNA, 3′ адаптер сначала ligated к sRNA (часто гель-очищенной от полной РНК) используя усеченную версию RNA ligase 2 (RNL2) и preadenylated 3′ адаптер(Рисунок 1) в отсутствии ATP. Это повышает эффективность перевязки sRNA-адаптера и уменьшает образование побочных реакций, таких как циркуляризация sRNA или конкатегоризация. Впоследствии 5′ адаптер сливается с помощью РНК лигаза 1 (RNL1), а затем обратная транскрипция (RT) и pcR усиление. Все эти шаги могут ввести предвзятость^3,4. Следовательно, считываемые числа могут не отражать фактические уровни экспрессии sRNA, ведущие к искусственным, зависимым от метода шаблонам выражения. Конкретные СРНК могут быть либо чрезмерно или недопредставлены в библиотеке, а сильно недопредставленные СРНк могут избежать обнаружения. Особенно сложная ситуация с растительными миРНКами, сиРНК у насекомых и растений, а также пиРНК у насекомых, нематод и млекопитающих, в которых 3′ терминальный нуклеотид имеет 2’O-метил (2′-OMe) модификацию¹. Эта модификация сильно подавляет перевязку 3′ адаптера^5,что делает подготовку библиотеки для этих типов РНК трудной задачей.

Предыдущая работа показала, что перевязка адаптера вводит серьезные предубеждения, из-за РНК последовательности / структурных эффектов^{6,7,8,9,10,11}. Шаги вниз по течению перевязки адаптера, такие как обратная транскрипция и ПЦР, существенно не способствуют смещению^6,11,12. Смещение лигации, вероятно, связано с тем, что молекулы адаптера с заданной последовательностью будут взаимодействовать с молекулами SRNA в реакционной смеси для формирования сгибов, что может либо привести к благоприятным или неблагоприятным конфигурациям для перевязки(рисунок 2). Данные Sorefan et al⁷ свидетельствуют о том, что RNL1 предпочитает один контекст, в то время как RNL2 предпочитает двойную нить для перевязки. Тот факт, что структуры совместного сгиба адаптера/sRNA определяются конкретным истектором адаптера и последовательностями sRNA, объясняет, почему конкретные sRNA чрезмерно или недопредставлены с данным набором адаптера. Важно также отметить, что в рамках серии библиотек sRNA для сопоставления следует использовать одни и те же последовательности адаптера. Действительно, ранее было отмечено, что изменение адаптеров путем введения различных последовательностей штрих-кодов изменяет профили miRNA в секвенирующих библиотеках^9,13.

Рандомизация последовательностей адаптера вблизи перевязочных узлов, вероятно, уменьшает эти предубеждения. Sorefan и коллеги⁷ использовали адаптеры с 4 случайных нуклеотидов на их конечностях, назначенных “Высокой четкости” (HD) адаптеры, и показал, что использование этих адаптеров привести к библиотекам, которые лучше отражают истинные уровни экспрессии SRNA. Более поздние работы подтвердили эти наблюдения и показали, что рандомизированный регион не должен быть рядом с перевязочную перевязку¹¹. Этот новый тип адаптеров был назван “MidRand” адаптеры. В совокупности эти результаты показывают, что улучшение конструкции адаптера может уменьшить предвзятость.

Вместо того, чтобы изменять адаптеры, смещение может быть подавлено путем оптимизации условий реакции. Полиэтиленгликоль (PEG), макромолекулярный скученность агент, как известно, увеличение эффективности перевязки¹⁴, было показано, значительно уменьшить предвзятость^15,16. На основе этих результатов на рынке появилось несколько комплектов “низкой предвзятости”. К ним относятся комплекты, которые используют PEG в реакции перевязки, либо в сочетании с классическими адаптерами или HD адаптеры. Другие комплекты избежать перевязки в целом, и использовать 3′ полиаденилаации и шаблона переключения для 3′ и 5′ адаптер дополнение, соответственно¹². В еще одной стратегии, 3′ перевязка адаптера сопровождается круговой шаг, таким образом, опуская 5′ адаптер перевязки¹⁷.

В предыдущем исследовании мы искали протокол подготовки библиотеки sRNA с наименьшими уровнями смещения и лучшим обнаружением 2′-OMe РНК^12. Мы протестировали некоторые из вышеупомянутых комплектов «низкого смещения», которые имели лучшее обнаружение 2′-OMe РНК, чем стандартный протокол (TS). Удивительно, однако, при модификации (использование рандомизированных адаптеров, PEG в реакции перевязки и удаление избытка 3′ адаптера путем очистки) последний превзошел другие протоколы для обнаружения 2′-OMe РНК. Здесь мы подробно описываем протокол, основанный на протоколе TS, ‘TS5′, который имел лучшее общее обнаружение 2′-OMe РНК. Протокол можно соблюдать с помощью реагентов из комплекта ТС и одного реагента из комплекта «Nf» или, чтобы сэкономить деньги, с помощью самодельных реагентов, с одинаковой производительностью. Мы также предоставляем подробный протокол для очистки сРНК от общей РНК и подготовки предаденина 3’ адаптера.