Summary

Makrofaj Alt Kümelerinin ve Stromal Hücrelerinin İnsan ve Fare Miyokardiyal Örneklerden İzolasyon

Published: December 17, 2019
doi:

Summary

Burada sunulan enzimatik sindirim yoluyla tek bir hücre süspansiyon hazırlayarak makrofajlar ve diğer bağışıklık dışı hücrelerin çeşitli alt kümeleri insan ve fare miyokardiyum izole etmek için bir protokoldür. Akış sitometrisine dayalı tanımlama ve izole makrofajların karakterizasyonu için gating şemaları da sunulmuştur.

Abstract

Makrofajlar kalpteki en heterojen ve bol immün hücre popülasyonlarını temsil eder ve kardiyak yaralanma sonrası inflamasyon ve reparative yanıtları yönlendirmede merkezi dir. Makrofajların çeşitli alt kümelerinin kardiyak yaralanma sonrası bağışıklık yanıtlarını nasıl düzenlediği aktif bir araştırma alanıdır. Burada sunulan basit bir protokol bizim laboratuvar rutin olarak gerçekleştirir, fare ve insan miyokard örnekleri sağlıklı ve hastalıklı bireylerden elde makrofajların çıkarılması için. Kısaca, bu protokol tek bir hücre süspansiyon oluşturmak için kardiyak doku enzimatik sindirim içerir, antikor boyama takip, ve akış sitometri. Bu teknik, sıralanmış hücrelerde yapılan fonksiyonel tahlillerin yanı sıra toplu ve tek hücreli RNA dizilimi için uygundur. Bu protokolün en büyük avantajı, sadeliği, günlük değişim ve çeşitli fare modelleri ve insan hastalığı varlıklar arasında makrofaj heterojenite sinin araştırılmasına olanak sağlayan geniş uygulanabilirliktir.

Introduction

Makrofajlar kalpte en bol bağışıklık hücre tipi temsil, ve onlarkardiyak yaralanma1,2,3,4aşağıdaki sağlam inflamatuar ve reparative yanıtlar üreten önemli rol oynamaktadır. Daha önce, grubumuz farklı gelişimsel kökenlerden elde edilen murin kalp makrofajlar iki büyük alt kümesi tespit5,6. Genel olarak, doku yerleşik kardiyak makrofaj alt kümelerinin farklı popülasyonları CCR2’nin hücre yüzey ekspresyonuna göre tanımlanabilir (C-C motifli kemokin reseptörü 2). CCR2 makrofajlar (hücre yüzey ekspresyonu: CCR2MHCIIdüşük ve CCR2MHCIIyüksek)embriyonik kökenlidir (ilkel ve eritromiyeloid soylar), kendini yenilemek mümkün, ve homeostatik koşullar altında baskın bir popülasyon temsil. Resident CCR2+ makrofajlar kesin hematopoetik kökenlidir, dolaşan monositlerden işe alım yoluyla korunur ve homeostatik koşullar altında küçük bir popülasyonu temsil eder. Fonksiyonel olarak, CCR2 makrofajlar minimal inflamasyon oluşturmak ve koroner gelişim neonatal kalp rejenerasyonu için kritikolan 5,7. Buna karşılık, CCR2+ makrofajlar kardiyak hakaret ler aşağıdaki sağlam inflamatuar yanıtlar başlatmak ve teminat kardiyomiyosit yaralanmasıkatkıda, sol ventrikül olumsuz remodeling, ve kalp yetmezliği ilerlemesi8,9.

Son zamanlarda, insan miyokardiyum da makrofajlar iki farklı alt kümesi ya CCR2olarak tanımlanan – ya da CCR2+8içerdiğini göstermiştir. Gen ekspresyonu ve fonksiyonel analizler, insan CCR2 ve CCR2+ makrofajlar fonksiyonel olarak farklı alt kümeleri temsil ve fonksiyonel CCR2 benzer olduğunu ortaya ve CCR2+ makrofajlar fare kalp bulundu. İnsan CCR2 makrofajlar IGF1, PDGF, Cyr61 ve HB-EGF gibi güçlü büyüme faktörleri düzeylerini ifade eder. CCR2+ makrofajlar il-1b, IL-6, CCL-2, CCL-7 ve TNF-a gibi iltihabı teşvik kemokinler ve sitokinler zenginleştirilmiştir. Uyarılmış CCR2+ makrofajlar kültürde inflamatuar sitokin interlökin-1β (IL-1β) belirgin olarak daha yüksek seviyelerde salgılarlar. Bu alt kümelerin doku onarımına nasıl farklı katkıda bulunduğu ve kardiyak yaralanma bağlamında sol ventrikül (LV) remodeling’in aktif bir araştırma alanı olduğu durmaktadır.

Fare ve insan kalbinde makrofaj heterojenite akış-sitometri tabanlı analizi kardiyak doku sindirerek ve akış sitometrik analiz veya hücre sıralama gibi toplu RNA sıralama / tek hücreli RNA sıralama veya fonksiyonel tahliller için hücreleri kültüre gibi daha fazla aşağı süreçleri için takip tek bir hücre süspansiyon oluşturma gerektirir. Murine kalplerden tek bir hücre süspansiyon yapmak için orijinal protokol ilk Nahrendorf grup tarafından Nahrendorf ve ark 200710 bildirilmiştir. Laboratuarımız protokolü insan miyokardiyumundan makrofajları çıkarmak için uyarladı ve değiştirdi. Aynı protokolü kullanarak ancak boyama ve gating düzeni hafif değişiklik ile, CD45 insan miyokardinden stromal hücreleri de hasat edilebilir. Burada sunulan, metin ve video, insan miyokardinden makrofajveya stromal çıkarılması için rutin olarak yapılan bir protokoldür.

Kardiyak doku örnekleri dilate kardiyomiyopati (DCM: idiyopatik veya ailesel) veya iskemik kardiyomiyopati (ICM) sol ventrikül yardımcı cihaz (LVAD) implantasyonu veya kardiyak transplantasyon geçiren erişkin hastalardan elde edilir. Ekskedeki kalpler veya LVAD çekirdekleri sindirim işlemine başlamadan önce intravasküler olarak soğuk tuzlu ile perfüzyonlanır. Yara izi veya yağ dokusu infiltrasyonu derecesi açısından belirlenen doku örneğinin “kalitesi”nin makrofajların verimini büyük ölçüde etkileyebileceği unutulmaması gerekir. Büyük yara izi alanlarına sahip kalp örnekleri çok daha düşük hücre verime sahip olacak ve istenilen downstream analiz yöntemleri in vitro hücre culturing gerektirdiğinde ciddi teknik sınırlama lar oluşturabilir.

Protocol

Sunulan protokol Washington Üniversitesi tarafından St. Louis Kurumsal İnceleme Kurulu (#201305086) tarafından onaylanmıştır. Tüm denekler numune toplamadan önce bilgilendirilmiş onay sağlar ve deneyler onaylı çalışma protokolüne uygun olarak gerçekleştirilir. Sunulan protokol, Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi’nin onayı ile gerçekleştirilir ve NIH Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı Kılavuzu’nda açıklanan yönergelere uyar. <…

Representative Results

Açıklanan protokol, makrofajların fare ve insan miyokardyumundan izole edilmesine olanak sağlar. Aynı protokolü kullanarak, ancak farklı bir boyama ve gating stratejisi ile, stromal hücreleri de insan miyokardiyum dan hasat edilebilir. Burada sunulan FACS sonuçları BD LSRII veya BD FACS ARIA III platformunda elde edilmiş. Lekeli splenositlerden alınan tek renk kontrol örneklerinden kompansasyon kontrolleri oluşturuldu. Şekil 1 işlenmemiş ve i…

Discussion

Protokol insan miyokardinden çeşitli makrofaj alt kümelerinin çıkarılmasına izin verir. Protokol basittir ve TEK hücreli süspansiyonun FACS analizine hazır hazırlanması 3 ila 4 saat sürer. Protokolün gerçekleÅ tirilmesi nispeten basit olsa da, değişkenliÄ i en aza indirecek bazı teknik yÃ1/4rÃ1/4tÃ1/4ler de vardır. Öncelikle, insan dokusu ile zamanında çalışma optimal hücre canlılığı için gereklidir. Hücre ölümünü en aza indirmek için dokuyu soğuk tuzlu/HBSS’de tutmak önemli…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu proje, Washington Üniversitesi Çocuk Keşif Enstitüsü ve St. Louis Çocuk Hastanesi (CH-II-2015-462, CH-II-2017-628), Barnes-Jewish Hastanesi Vakfı (8038-88) ve NHLBI (R01) tarafından sağlanan finansmanla mümkün olmuştur. HL138466, R01 HL139714). K.J.L. NIH K08 HL123519 ve Burroughs Karşılama Fonu (1014782) tarafından desteklenir.

Materials

15 mL Conocal Tubes Thermo Fisher 14-959-53A
40 µm Cell Strainers Thermo Fisher 50-828-736
50 mL Conical Tubes Thermo Fisher 352098
ACK Lysis Buffer Gibco A10492-01
Bovine Serum Albumin Sigma A2058
Collagenase 1 Sigma C0130-1G
DAPI Thermo Fisher D1306
DMEM 1x Gibco 11965-084
DNAse 1 Sigma D4527-20KU
DRAQ5 Thermo Fisher 62251
EDTA 0.5M pH 8 Corning 46-034-CI
Enzyme Deactivating Buffer 490 mL HBSS, 10 mL FBS, 1 g BSA
FACS Buffer 976 mL PBS, 20 mL FBS, 4mL EDTA (0.5M)
Fetal Bovine Serum Gibco A3840201
Forceps VWR 82027-406
HBSS 1x Gibco 14175-079
Hemostats VWR 63042-052
Hyaluronidase type 1-s Sigma H3506-500MG
PBS 1x Gibco 14190-136
Petridishes Thermo Fisher 172931
Razor Blade VWR 55411-050
Scissors VWR 82027-578

Referências

  1. Pinto, A. R., et al. An abundant tissue macrophage population in the adult murine heart with a distinct alternatively-activated macrophage profile. PLoS One. 7 (5), e36814 (2012).
  2. Hulsmans, M., et al. Macrophages facilitate electrical conduction in the heart. Cell. 169 (3), 510-522 (2017).
  3. Hulsmans, M., et al. Cardiac macrophages promote diastolic dysfunction. Journal of Experimental Medicine. 215 (2), 423-440 (2018).
  4. Aurora, A. B., et al. Macrophages are required for neonatal heart regeneration. Journal of Clinical Investigation. 124 (3), 1382-1392 (2014).
  5. Lavine, K. J., et al. Distinct macrophage lineages contribute to disparate patterns of cardiac recovery and remodeling in the neonatal and adult heart. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (45), 16029-16034 (2014).
  6. Epelman, S., et al. Embryonic and adult-derived resident cardiac macrophages are maintained through distinct mechanisms at steady state and during inflammation. Immunity. 40 (1), 91-104 (2014).
  7. Leid, J., et al. Primitive embryonic macrophages are required for coronary development and maturation. Circulation Research. 118 (10), 1498-1511 (2016).
  8. Bajpai, G., et al. The human heart contains distinct macrophage subsets with divergent origins and functions. Nature Medicine. 24 (8), 1234-1245 (2018).
  9. Dick, S. A., et al. Self-renewing resident cardiac macrophages limit adverse remodeling following myocardial infarction. Nature Immunology. 20, 29-39 (2019).
  10. Nahrendorf, M., et al. The healing myocardium sequentially mobilizes two monocyte subsets with divergent and complementary functions. Journal of Experimental Medicine. 204 (12), 3037-3047 (2007).

Play Video

Citar este artigo
Bajpai, G., Lavine, K. J. Isolation of Macrophage Subsets and Stromal Cells from Human and Mouse Myocardial Specimens. J. Vis. Exp. (154), e60015, doi:10.3791/60015 (2019).

View Video