Este protocolo describe un enfoque para producir hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes humanas utilizando un sistema de cultivo definido y un autoensamblaje celular. Este protocolo es reproducible en una serie de líneas celulares, rentable y permite la producción de hepatóferas humanas estables para aplicación biomédica.
El desarrollo de fuentes renovables de tejido hepático es necesario para mejorar el modelado basado en células, y desarrollar tejido humano para el trasplante. Las células madre embrionarias humanas (hESC) y las células madre pluripotentes inducidas por el hombre (hiPSC) representan fuentes prometedoras de esferas hepáticas humanas. Hemos desarrollado un método de diferenciación celular libre de suero y definido para generar esferas hepáticas humanas tridimensionales formadas a partir de células madre pluripotentes humanas. Una limitación potencial de la tecnología es la producción de esferas densas con material muerto en su interior. Para evitar esto, hemos empleado la tecnología de micropozo de agarosa en densidades celulares definidas para controlar el tamaño de las esferas 3D, evitando la generación de núcleos apoptoticos y/o necróticos. En particular, las esferas generadas por nuestro enfoque muestran la función hepática y el fenotipo estable, representando un recurso valioso para la investigación científica básica y aplicada. Creemos que nuestro enfoque podría utilizarse como una tecnología de plataforma para desarrollar más tejidos para modelar y tratar enfermedades humanas y en el futuro puede permitir la generación de tejido humano con arquitectura compleja de tejidos.
La capacidad de las células madre pluripotentes humanas (hPSC) para autorenovarse, conservando al mismo tiempo la pluripotencia, brinda la oportunidad de producir tipos de células humanas y tejidos bajo demanda. hPSCs se han diferenciado eficientemente en células similares a hepatocitos (HHL) utilizando sistemas de cultivo adherente bidimensionales (2D)1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Estos sistemas se han utilizado para modelar con éxito la enfermedad monogénica, el ciclo de vida del virus, la lesión hepática inducida por medicamentos (DILI), la exposición fetal a toxinas y la enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD)11,12,13 ,14,15. Sin embargo, estos modelos poseen algunos inconvenientes, que limitan su uso rutinario. Estos incluyen la expresión del marcador fetal, el fenotipo inestable y la mala arquitectura tisular16,17,18,19, que también podría limitar la extrapolación a la función del órgano in vivo.
Para superar estas limitaciones, se han desarrollado plataformas de diferenciación tridimensionales (3D) para imitar la arquitectura de tejido in vivo. Aunque permiten, esos enfoques se basan en el uso de productos y matrices derivados de animales para impulsar la génesis de los tejidos20,21,22, limitando el escalado y la aplicación generalizada.
Aquí, detallamos procedimientos para generar grandes cantidades de hepatósferas 3D a partir de hPSCs utilizando materiales definidos y autoensamblaje celular. En particular, el tejido generado por nuestro procedimiento permanece funcional durante más de un año en el cultivo celular y es capaz de apoyar la función hepática in vivo23.
En resumen, nuestro enfoque de diferenciación definido permite la generación de hepatosferas humanas estables tanto a partir de células madre embrionarias humanas (HESC) como de células madre pluripotentes inducidas (iPSC). Creemos que el procedimiento descrito representa un avance significativo en la generación de hepatoesferas 3D para la investigación científica básica y aplicada.
El desarrollo de sistemas definidos y libres de xeno para producir hepatoesferas humanas en 3D es necesario tanto para los esfuerzos in vitro como in vivo. En la actualidad, la mayoría de los enfoques de diferenciación de hepatocitos de células madre pluripotentes humanas se realizan en cultivos adherentes bidimensionales. Estos ambientes carecen de muchas de las señales ambientales involucradas en la génesis de tejidos y homeostasis que incluyen; interacciones celulares heterotípicas, producción y remodelación de matrices, lo que resulta en una mala traducción a la biología in vivo18,19.
Como resultado, la investigación se ha centrado en enfoques alternativos para generar hepatoesferas a partir de células madre pluripotentes. Varios estudios 3D han avanzado en el campo, pero éstos dependen de productos animales20,22,24 para proporcionar apoyo y / o requieren el uso de tejido humano21,22 que complica escalatecnológica y compromete la reproducibilidad experimental y la aplicación.
El procedimiento descrito en nuestro artículo (Figura1) es definido, eficiente, altamente reproducible y rentable, permitiendo la producción de esferas hepáticas funcionales, que permanecen funcionales durante un año in vitro y proporcionan apoyo hepático crítico en vivo14. Es importante destacar que esta plataforma permite al usuario controlar el tamaño de las esferas hepáticas 3D, limitando la formación de centros necróticos densos y la pérdida de fenotipo.
La transferencia de las hepatóferas 3D a las placas recubiertas de poli-HEMA representa un paso crítico en este protocolo. Es importante pipetear suavemente en esta etapa del procedimiento para evitar dañar la esfera. Además, los cambios de medios deben realizarse cuidadosamente para evitar la tensión de cizallamiento y la distorsión de la estructura de la esfera.
En estos estudios, las hepatóferas 3D mostraron una estructura organizada (Figura2 y Figura3), función del citocromo P450 (Figura4)y proteínas hepáticas secretadas, incluida la albúmina y la alfa-fetoproteína (Figura5). Este procedimiento se ha realizado con éxito en cuatro líneas de células madre pluripotentes con resultados comparables. De cara al futuro, esta tecnología podría emplearse como plataforma para desarrollar más tejidos endodérmicos y mesenquimales con arquitecturas complejas.
The authors have nothing to disclose.
Este estudio fue apoyado con premios de la Plataforma de Medicina Regenerativa del Reino Unido (MRC MR/L022974/1) y la Oficina del Científico Jefe (TCS/16/37).
Cell Culture and functional assays | |||
Agarose | Fisher Bioreagents | 10766834 | |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 | |
beta-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2058 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | |
DPBS, no calcium, no magnesium | ThermoFisher | 14190250 | |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 | |
Gentle cell dissociation reagent | STEMCELL Technologies | 7174 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 | |
HepatoZYME-SFM | Life Technologies | 17705021 | |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E | |
Human Alpha Fetoprotein ELISA | Alpha Diagnostics | 500 | |
Human Basic Fibrobaslt Growth Factor | Peprotech | 100-18B | |
Human Epithelial Gropwth Factor | Peprotech | 236-EG | |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 | |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 | |
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 | |
Human Serum Albumin ELISA | Alpha Diagnostics | 1190 | |
Human Vascular Growth Factor | Bio-techne | 293-VE | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 | |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 | |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 | |
Micro-mold spheroids | Sigma-Aldrich | Z764000 | |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 5850 | |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | |
P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System | Promega | V8771 | |
P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System | Promega | V8801 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140122 | |
poly-HEMA (Poly 2-hydorxyethyl methacrylate) | Sigma-Aldrich | P3932 | |
Recombinant mouse Wnt3a | Bio-techne | 1324-WN-500/CF | |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 | |
Equipment | |||
Microwave | Bosch | ||
Microtome | Leika | RM2125RT | |
Oven | Thermoscientific | ||
Antibodies | |||
Primary antibodies | |||
Albumin | Sigma-Aldrich | A6684 | 1:100 (mouse) |
CYP3A4 | University of Dundee | University of Dundee | 1:200 (sheep) |
E-cadherin | Abcam | ab76055 | 1:200 (mouse) |
HNF-4α | Santa Cruz | sc-8987 | 1:100 (rabbit) |
IgG | DAKO | X0943 | 1:400 |
Vimentin | DAKO | M0725 | 1:100 (sheep) |