Summary

Identificare le mutazioni con lo scioglimento ad alta risoluzione in una popolazione di riso TILLING

Published: September 02, 2019
doi:

Summary

In questo articolo, presentiamo il protocollo descritto come ad alta risoluzione di fusione di analisi di fusione (HRM)-based Target Induced Local Lesions In ducedato In genomes (TILLING). Questo metodo utilizza cambiamenti di fluorescenza durante la fusione del DNA duplex ed è adatto per lo screening ad alto throughput di inserimento/eliminazione (Indel) e singola sostituzione di base (SBS).

Abstract

Target Induced Local Lesions In Genomes (TILLING) è una strategia di genetica inversa per lo screening ad alto throughput delle mutazioni indotte. Tuttavia, il sistema TILLING ha meno applicabilità per il rilevamento di inserimento/eliminazione (Indel) e TILLING tradizionale richiede passaggi più complessi, come la digestione di nucleale CEL I e l’elettroforesi gel. Per migliorare la produttività e l’efficienza di selezione, e per rendere possibile lo screening di entrambi gli Indels e le singole sottostizioni di base (SBS), viene sviluppato un nuovo sistema DI fusione ad alta risoluzione (HRM) basato su . Qui, presentiamo un protocollo DETTAGLIATO HRM-TILLING e mostriamo la sua applicazione nello screening delle mutazioni. Questo metodo è in grado di analizzare le mutazioni degli amplificatori PCR misurando la denaturazione del DNA a doppio filamento ad alte temperature. L’analisi HRM viene eseguita direttamente dopo la PCR senza ulteriori elaborazioni. Inoltre, un metodo di estrazione del DNA semplice, sicuro e veloce (SSF) è integrato con HRM-TILLING per identificare sia Indels che SBS. La sua semplicità, robustezza e produttività elevata lo rendono potenzialmente utile per la scansione delle mutazioni nel riso e in altre colture.

Introduction

I mutanti sono importanti risorse genetiche per la ricerca di genomica funzionale delle piante e l’allevamento di nuove varietà. Un approccio genetico in avanti (cioè dalla selezione mutante alla clonazione genica o allo sviluppo di varietà) era il metodo principale e unico per l’uso di mutazioni indotte circa 20 anni fa. Lo sviluppo di un nuovo metodo di genetica inversa, TILLING (Targeting Induced Local Lesions In Genomes) di McCallum et al.1 ha aperto un nuovo paradigma e da allora è stato applicato in un gran numero di specie animali e vegetali2. TILLING è particolarmente utile per l’allevamento di tratti tecnicamente difficili o costosi da determinare (ad esempio, resistenza alle malattie, contenuto minerale).

TILLING è stato inizialmente sviluppato per le mutazioni dei punti di screening indotte da mutageni chimici (ad esempio, EMS1,3). Esso comprende i seguenti passaggi: la creazione di una popolazione/e TILLING; preparazione e raggruppamento del DNA di singole piante; amplificazione PCR del frammento di DNA bersaglio; eterodulessi formazione per denaturazione e annessione di amplificatori PCR e scissione da ceL I nucleasi; e l’identificazione degli individui mutanti e delle loro specifiche lesioni molecolari3,4. Tuttavia, questo metodo è ancora relativamente complesso, richiede tempo e bassa velocità effettiva. Per renderlo più efficiente e con una maggiore produttività, sono stati sviluppati molti metodi TILLING modificati, come la cancellazione DI TILLING (De-TILLING) (Tabella 1)1,3,5,6, 7,8,9,10,11,12.

L’analisi della curva HRM, che si basa sui cambiamenti di fluorescenza durante lo scioglimento del DNA duplex, è un metodo semplice, conveniente e ad alta produttività per lo screening delle mutazioni e la genotipizzazione13. HRM è già stato ampiamente utilizzato nella ricerca vegetale tra cui HRM basato SU TILLING (HRM-TILLING) per lo screening delle mutazioni SBS indotte dalla mutagenesi EMS14. Qui, abbiamo presentato protocolli HRM-TILLING dettagliati per lo screening delle mutazioni (sia Indel che SBS) indotti dai raggi gamma (z) nel riso.

Protocol

1. Preparativi Sviluppo delle popolazioni mutagenizzate a raggi di raggi Trattare circa 20.000 semi di riso essiccati (con contenuto di umidità di ca. 14%) di una linea di riso japonica (ad esempio, DS552) con 137raggi gamma Cs a 100 Gy (1 Gy/min) in un impianto di irradiazione z (ad esempio, cellula gamma).NOTA: I semi utilizzati per il trattamento devono avere un’elevata redditività (ad esempio, con un tasso di germinazione >85%). La dose di irradi…

Representative Results

Scansione e analisi HRM In totale, sono stati prodotti e sottoposti ad amplificazione PCR 1.140 campioni di DNA in pool da 4.560 M2. Due frammenti delle dimensioni di 195 bp e 259 bp sono stati amplificati rispettivamente per OsLCT1 e SPDT(tabella2). La maggior parte dei campioni presentava curve di fusione non significativamente diverse da quella del WT (WT & lt; 0,05). Le curve HRM significativamente diverse dal WT (F > 0,05) son…

Discussion

TILLING si è dimostrato un potente strumento genetico inverso per identificare le mutazioni indotte per l’analisi funzionale genica e l’allevamento delle colture. Per alcuni tratti non facilmente osservabili o determinati, TILLING con rilevamento di mutazioni ad alto contenuto di velocità PCR può essere un metodo utile per ottenere mutanti per diversi geni. Il metodo HRM-TILLING è stato utilizzato nelle popolazioni mutagenizzate Di pomodoro12,grano11 e vine<sup class="x…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Key Research and Development Program of China (n. 2016YFD0102103) e dalla National Natural Science Foundation of China (N. 31701394).

Materials

2× Taq plus PCR Master Mix Tiangen, China KT201 PCR buffer, dNTP and polymerase for PCR amplification
96-well plate Bio-rad, America MSP-9651 Specific plate for PCR in HRM analysis
Mastercycler nexus Eppendorf, German 6333000073 PCR amplification
LightScanner Idaho Technology, USA LCSN-ASY-0011 For fluorescence sampling and processing
CALL-IT 2.0 Idaho Technology, USA For analysis of the fluorescence change
EvaGreen Biotium, USA 31000-T Fluorescence dye of HRM
Nanodrop 2000 Thermo Scientific, USA ND2000 For DNA quantification

Referências

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Citar este artigo
Li, S., Yu, Y., Liu, S., Fu, H., Huang, J., Shu, Q., Tan, Y. Identifying Mutations by High Resolution Melting in a TILLING Population of Rice. J. Vis. Exp. (151), e59960, doi:10.3791/59960 (2019).

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