जांच इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री के लिए नमूना तैयारी
Summary
यह लेख परिवेश जन स्पेक्ट्रोमेट्री के आधार पर एक अद्वितीय वास्तविक समय विश्लेषणात्मक विधि के लिए नमूना तैयारी विधियों का परिचय देता है। यह विधि हमें बिना किसी विशेष पूर्वउपचार के वीवो में जैविक अणुओं का वास्तविक समय विश्लेषण करने देती है।
Abstract
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान में एक शक्तिशाली उपकरण है क्योंकि यह अणुओं के बारे में बहुत सटीक जानकारी प्रदान करता है, जैसे बड़े पैमाने पर चार्ज अनुपात(एम/जेड),जो आणविक वजन और संरचनाओं को कम करने के लिए उपयोगी हैं । हालांकि यह अनिवार्य रूप से एक विनाशकारी विश्लेषणात्मक विधि है, परिवेश आयनीकरण तकनीक में हाल ही में प्रगति ने हमें अखंडता के मामले में अपेक्षाकृत बरकरार राज्य में ऊतक छोड़ते हुए डेटा प्राप्त करने में सक्षम बनाया है। प्रोब इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (पेसी) एक तथाकथित प्रत्यक्ष विधि है क्योंकि इसके लिए नमूनों के जटिल और समय लेने वाले पूर्वउपचार की आवश्यकता नहीं होती है। एक ठीक सुई एक नमूना बीनने के रूप में कार्य करता है, साथ ही एक आयनीकरण उत्सर्जक। जांच टिप के बहुत तेज और ठीक संपत्ति के आधार पर, नमूनों का विनाश कम है, जिससे हमें सीटू में जीवित चीजों से वास्तविक समय की आणविक जानकारी प्राप्त करने की अनुमति मिलती है। इसके साथ, हम पेसी-एमएस तकनीक के तीन अनुप्रयोगों को पेश करते हैं जो जैव चिकित्सा अनुसंधान और विकास के लिए उपयोगी होंगे। एक ठोस ऊतक है, जो चिकित्सा निदान के लिए इस तकनीक का बुनियादी आवेदन है करने के लिए आवेदन शामिल है । चूंकि इस तकनीक के लिए केवल 10 मिलीग्राम नमूने की आवश्यकता होती है, इसलिए यह नियमित नैदानिक सेटिंग्स में बहुत उपयोगी हो सकता है। दूसरा आवेदन इन विट्रो मेडिकल डायग्नोस्टिक्स के लिए है जहां मानव रक्त सीरम मापा जाता है। तरल पदार्थ के नमूनों को मापने की क्षमता विभिन्न जैविक प्रयोगों में भी मूल्यवान है जहां पारंपरिक विश्लेषणात्मक तकनीकों के लिए पर्याप्त मात्रा में नमूने प्रदान नहीं किए जा सकते हैं। तीसरा आवेदन जीवित जानवरों में जांच सुइयों के प्रत्यक्ष आवेदन की ओर झुक जाता है, जहां हम विशिष्ट अंगों में मेटाबोलिट्स या दवाओं की वास्तविक समय की गतिशीलता प्राप्त कर सकते हैं। प्रत्येक आवेदन में, हम उन अणुओं का अनुमान लगा सकते हैं जिन्हें एमएस द्वारा पाया गया है या चिकित्सा निदान प्राप्त करने के लिए कृत्रिम बुद्धिमत्ता का उपयोग करसकते हैं।
Introduction
मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) कटौती वाद की एक तकनीकी प्राप्ति है; यह विश्लेषण की वस्तु को एक इकाई में कम कर देता है जिसे आणविक प्रजातियों या झरने के आधार पर व्याख्या की जा सकती है। इसलिए, यह विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान का एक प्रतिनिधि विधि है। यह चार प्रक्रियाओं से बना है: आयनीकरण, विश्लेषण, पता लगाने, और स्पेक्ट्रल अधिग्रहण। क्योंकि अणु का आयनीकरण द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री में पहली प्रक्रिया है, यह आम तौर पर एनालाइट्स के रूप को संसाधित करने के लिए प्रतिबंधित करता है। अधिकांश आयनीकरण प्रक्रियाओं के लिए कार्बनिक नमूनों की संरचना, आकृति विज्ञान और वास्तविक समय की जैविक प्रक्रियाओं के विनाश की आवश्यकता होती है। उदाहरण के लिए, इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ईएसआई) एमएस के लिए आवश्यक है कि नमूने कुशल आयनीकरण1के लिए तरल स्थिति में हों। इसलिए, नमूनों को एक जटिल जैव रासायनिक तैयारी से गुजरना चाहिए, जो अणुओं की संरचना को बदल देता है। वैकल्पिक रूप से, जबकि मैट्रिक्स की सहायता से लेजर अवशोषण आयनीकरण (MALDI) एमएस पतली खंडित ऊतक2,3केआणविक नक्शे का पुनर्निर्माण कर सकते हैं, इसकी आयनीकरण दक्षता नमूनों में सभी अणुओं का पता लगाने के लिए बहुत कम है, और यह फैटी एसिड का विश्लेषण करने में विशेष रूप से गरीब है । इन सीमाओं को ध्यान में रखते हुए, प्रोप इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (पेसी)4 का उपयोग संरचनात्मक अखंडता5को नष्ट किए बिना सीटू में जैविक प्रणालियों में वास्तविक समय परिवर्तन ों का पालन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि जैविक जीव को देखा जा रहा है तकनीकी रूप से एक जीवित स्थिति में है। इस मामले में एक बहुत अच्छी सुई का उपयोग किया जाता है जो एक नमूना बीनने वाले और आयन उत्सर्जक के रूप में एक साथ कार्य करता है। इसका मतलब यह है कि जटिल नमूना पूर्वउपचार दृश्यों को बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा प्राप्त करने के लिए नजरअंदाज किया जा सकता है जो सीटू में रहने वाली प्रणाली के आणविक घटकों को प्रतिबिंबित करता है।
कई अन्य आयनीकरण विधियां हैं जो पेसी-एमएस को प्रतिद्वंद्वी करते हैं। एक तेजी से वाष्पीकरण आयनीकरण मास स्पेक्ट्रोमेट्री (रिम्स)6है । यह तकनीक सर्जरी के दौरान अच्छी तरह से काम करती है क्योंकि यह एक विद्युत चाकू के साथ इकट्ठा होती है और चीरा के दौरान उत्पन्न आयन पंख एकत्र करती है। जबकि रिम्स सर्जरी के लिए बहुत उपयोगी है, यह अनिवार्य रूप से एक विनाशकारी तरीका है कि ऊतक के विद्युत एब्लेशन की आवश्यकता है । इसलिए, यह एक तैयारी के नमूने में या प्रयोगशाला विश्लेषण में कोशिकाओं और ऊतकों के विस्तृत विश्लेषण के लिए उपयोगी नहीं है। इसके अलावा, क्योंकि यह ऊतक मलबे युक्त पंख की एक बड़ी राशि एकत्र करता है, यह प्रत्येक उपयोग के बाद उपकरणों के लंबे रखरखाव की आवश्यकता है, इस प्रकार विशेष शल्य चिकित्सा प्रक्रियाओं के लिए इस मशीन के उपयोग को सीमित । एक ऐसी ही विधि, जिसे लेजर डिजनराइजेशन मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एलडीआई-एमएस)7कहा जाता है, एक और तकनीक है जो सतह विश्लेषण के लिए गैर-आक्रामक और उपयोगी है। क्योंकि यह तकनीक एक नमूने की सतह को स्कैन करने में अच्छी है, यह माल्डी इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री8,9जैसे व्यापक द्वि-आयामी विश्लेषण प्राप्त करती है। हालांकि, क्योंकि एलडीआई-एमएस केवल सतह विश्लेषण पर लागू होता है, इसलिए ऊतक के भीतर नमूनों का विश्लेषण करने के लिए पेसी-एमएस लाभप्रद है। एक और तकनीक, MasSpec कलम10,थायराइड कैंसर के निदान में उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता को प्राप्त करने के लिए सूचित किया गया था, लेकिन जांच का व्यास मिमी के क्रम में है और यह सतह विश्लेषण के लिए विशिष्ट है, जिसका अर्थ है कि यह कैंसर या गहराई से स्थानीय घावों के छोटे पिंड का पता नहीं लगा सकता है । इसके अलावा, चूंकि यह विधि जांच पेन में एम्बेडेड माइक्रोकेपिलरी प्रवाह नहर का उपयोग करती है, इसलिए एलडीआई-एमएस के समान क्रॉस-संदूषण को ध्यान में रखा जाना चाहिए। अन्य तकनीकें मौजूद हैं जिन्हें नैदानिक सेटिंग्स पर लागू किया गया है, जैसे प्रवाह जांच और आयनीकरण फॉर्म झाड़ू11,लेकिन वे व्यापक नहीं हैं।
पेसी ईएसआई का चरम लघुकरण है, जिसमें नैनो-इलेक्ट्रोस्प्रे का केशिका कई सौ एनएम के टिप वक्रता त्रिज्या के साथ एक ठोस सुई पर एकाग्र होता है। आयनीकरण सुई टिप के अत्यंत प्रतिबंधित क्षेत्र में टेलर शंकु बनाकर होता है, जिस पर नमूने तब तक रहते हैं जब तक कि टिप पर सभी तरल पदार्थ का आयनीकरण12पूरा नहीं हो जाता है। यदि एनालाइट धातु की सुई की नोक पर रहता है, तो धातु की सुई और एनालाइट्स के बीच इंटरफेस पर अतिरिक्त चार्ज लगातार उत्पन्न होता है। इसलिए, अणुओं का अनुक्रमिक आयनीकरण उनकी सतह गतिविधि के आधार पर होता है। यह गुण सुई टिप को एक प्रकार का क्रोमेटोग्राम बनाता है, जो उनकी सतह गतिविधि के आधार पर एनालाइट्स को अलग करता है। अधिक तकनीकी रूप से, मजबूत सतह गतिविधि वाले अणु टेलर शंकु की सतह पर आते हैं और कमजोर सतह गतिविधि वाले लोगों की तुलना में पहले आयनीकृत होते हैं, जो आयनीकरण प्रक्रिया के अंत तक सुई की सतह का पालन करते हैं। इस प्रकार, सुई द्वारा उठाए गए सभी अणुओं का पूर्ण आयनीकरण13प्राप्त किया जाता है। इसके अलावा, क्योंकि इस तकनीक में नमूने के लिए अनावश्यक विलायक के अलावा शामिल नहीं है, कई सैकड़ों फेम्टोलीटर आगे विश्लेषण14के लिए पर्याप्त मजबूत करने के लिए पर्याप्त हैं। ये गुण अक्षुण्ण जैविक नमूनों के विश्लेषण के लिए लाभप्रद हैं। हालांकि, पेसी-एमएस का एक बड़ा नुकसान आयनीकरण में विच्छेदन में निहित है क्योंकि ऊर्ध्वाधर धुरी के साथ सुई के विनिमय आंदोलन, एक चीरा मशीन के समान है। आयनीकरण केवल तब होता है जब जांच की नोक उच्चतम बिंदु तक पहुंचती है जब आयन छिद्र की ऊंचाई क्षैतिज धुरी पर गठबंधन होती है। आयनीकरण बंद हो जाता है, जबकि सुई नमूने उठाता है, और इसलिए आयनीकरण की स्थिरता पारंपरिक ईएसआई में उसके बराबर नहीं है। इसलिए, पेसी-एमएस प्रोटेओमिक्स के लिए एक आदर्श विधि नहीं है।
आज तक, पेसी-एमएस को मुख्यतजैविक प्रणालियों के विश्लेषण के लिए लागू किया गया है, जिसमें बुनियादी अनुसंधान से लेकर नैदानिक सेटिंग्स तक क्षेत्रों की एक विस्तृत श्रृंखला शामिल है। उदाहरण के लिए, सर्जरी के दौरान तैयार मानव ऊतक का प्रत्यक्ष विश्लेषण गुर्दे की कोशिका कार्सिनोमा15 और फैरिंगियल स्क्वैमस कार्सिनोमा16दोनों में ट्राइसिल्ग्लिसरोल के संचय को प्रकट करने में सक्षम था। लिपिड प्रोफाइल पर ध्यान केंद्रित करने के लिए यह विधि रक्त जैसे तरल नमूनों को भी माप सकती है। उदाहरण के लिए, खरगोशों में आहार परिवर्तन के दौरान कुछ अणुओं को रेखांकित किया गया है; यह बताया गया था कि इन अणुओं में से कुछ प्रयोगों के बहुत प्रारंभिक दौर में कमी आई, उच्च संवेदनशीलता और नैदानिक निदान17के लिए इस प्रणाली की उपयोगिता का संकेत . इसके अलावा, एक जीवित जानवर के लिए सीधे आवेदन उपवास5की सिर्फ एक रात के बाद जिगर के जैव रासायनिक परिवर्तन का पता लगाने की अनुमति दी । Zaitsu एट अल18 ने इस प्रयोग5 पर फिर से गौर किया और लगभग उसी तरह जिगर के मेटाबोलिक प्रोफाइल का विश्लेषण किया, परिणामों के साथ जो हमारी मूल विधि की स्थिरता और प्रजनन क्षमता को मजबूत करते हैं। इसके अलावा, हम इस तकनीक19का उपयोग कर चूहों में गैर कैंसर जिगर आसपास से कैंसर के ऊतकों भेदभाव करने में सक्षम थे । इसलिए, यह एक बहुमुखी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री तकनीक है जो वीवो और इन विट्रो दोनों में विभिन्न सेटिंग्स में उपयोगी है। एक और दृष्टिकोण से, पेसी मॉड्यूल बढ़ते लगाव को समायोजित करके विभिन्न द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर फिट करने के लिए बनाया जा सकता है। इस छोटे से लेख में, हम जीवितजानवरोंके साथ अनुप्रयोगों सहित अनुप्रयोगों(चित्रा 1)की मूल बातें और उदाहरण पेश करते हैं ।
प्रत्येक देश में विनियमों और कानूनों के अनुसार, प्रत्येक संस्थान के मानदंडों को पूरा करने के लिए इस प्रोटोकॉल के कुछ हिस्सों को संशोधित करने की आवश्यकता होगी । जीवित जीव के लिए आवेदन सबसे दिलचस्प और चुनौतीपूर्ण है क्योंकि यह सीटू में जीवित जानवरों में ऊतकों या अंगों में जैव रासायनिक या मेटाबोलिक परिवर्तन प्रदान कर सकता है। हालांकि इस आवेदन को यामांशी विश्वविद्यालय में पशु देखभाल के लिए संस्थागत समिति द्वारा अनुमोदित किया गया था, २०१३५में, पशु प्रयोगों के लिए विनियमों में हाल ही में परिवर्तन के कारण अनुमोदन का एक और दौर अब आवश्यक होगा । इसलिए प्रायोगिक योजना में कई संशोधन ों की सलाह दी जाती है। प्रयोगों में प्राप्त द्रव्यमान स्पेक्ट्रा के बारे में, प्रत्येक माप के बीच बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रा के उतार-चढ़ाव को ध्यान में रखते हुए, कोई स्पेक्ट्रल सूचना साझा करने की प्रणाली नहीं है जो न्यूक्लियोटाइड अनुक्रमण समुदाय के लिए आम है। ध्यान रखना चाहिए जब ऑपरेटर सुई-स्टिक दुर्घटनाओं से बचने के लिए सुई संभालता है, खासकर जब सुई धारक से सुई को हटा। सुई को अलग करने के लिए एक विशेष उपकरण इस उद्देश्य के लिए बहुत उपयोगी है। चूंकि पेसी मॉड्यूल का डिब्बा एक एयरटाइट, बंद कक्ष है, इसलिए निर्देशों के अनुसार द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर संचालित होने पर आयन पंख का रिसाव नहीं होता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
यद्यपि पेसी द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री4के लिए ईएसआई का व्युत्पन्न है, यह वास्तविक समय के मेटापोलोमिक्स की निगरानी के साथ-साथ किसीभी जटिल या समय लेने वाले प्रीट्रीटमेंट्स5,<sup class="…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम अपनी सचिवाला सहायता के लिए पेसी-एमएस और काज़ुको सावा-नोबोरी के संचालन के लिए अयुमी इजुका को धन्यवाद देते हैं । हम इस पांडुलिपि के मसौदे के संपादन के लिए एडिंज समूह (www.edanzediting.com/ac) से ब्रोनवेन गार्डनर, पीएचडी का शुक्रिया अदा करते हैं ।
Materials
| 5-Fluoro-2'-deoxyuridine (5-FdU) | Sigma-Aldrich | F8791-25MG | 25mg |
| disposable biposy punch (Trepan) | kai Europa GmbH | BP-30F | bore size 3mm |
| ethanol | nacalai tesque | 14710-25 | extra pure reagent |
| LabSolutions | Shimadzu | ver. 5.96, Data analyzer | |
| micropestle | United Scientific Supplies | S13091 | |
| microtube | Treff | 982855 | 0.5 mL clear |
| PESI-MS (Direct Probe Ionization-MS) | Shimadzu | DPiMS-2020 | Mass spectrometer equipped with PESI |
| PPGT solition | Shimadzu | ND | Attached to DPiMS-2020 |
Referências
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