Les deux règles d'ADN étudieront le mécanisme de la translocation de Ribosome avec la résolution d'un seul nucléotide

Le déplacement biomoléculaire est un paramètre fondamental dans l’étude du mécanisme des fonctions biologiques connexes. Un exemple particulier est la translocation ribosome^1,2, au cours de laquelle le ribosome se déplace par exactement trois nucléotides (nt) sur l’ARN messager (ARNm) normalement, et par un, deux, ou d’autres nombres de nt sauf trois dans le cas de frameshifting. Par conséquent, une résolution mono-nt du système de règle moléculaire est nécessaire pour distinguer les différentes tailles d’étape. Un plus grand défi est de sonder le mouvement ribosome sur les côtés d’entrée et de sortie. En d’autres termes, ce n’est qu’avec un système de double règle que nous serons en mesure de révéler si l’ARNm est fileté en douceur à travers le ribosome, ou il ya des étapes intermédiaires dans lesquelles les deux côtés ont des tailles d’étapes différentes conduisant à une conformation arnde plissée ou en boucle à l’intérieur de la Ribosome.

Plusieurs méthodes ont été développées pour relever le premier défi de résoudre différentes étapes sur le côté de sortie du ribosome (l’extrémité 3′ de l’ARNm). Le double bifuséré résout les différents cadres de lecture en mesurant les rapports des différentes protéines résultantes^3,4. Il n’est applicable que pour la fin 3′ de l’ARNm et donc insuffisant pour fournir une image complète de la translocation. La spectrométrie de masse peut analyser les différents fragments de peptides comme conséquence des réarrangements de code correspondants⁵. Mais il ne peut pas identifier combien nt le ribosome se déplace sur l’ARNm. L’assay d’impression d’orteil est une autre méthode commune qui emploie une transcriptase inverse amorcée àl’extrémité 3′-distal pour transcrire l’ARNm vers le ribosome 6. Cependant, il n’est pas applicable pour la fin de 5′ de l’ARNm qui entre dans le ribosome. D’autres techniques, y compris les approches à molécule unique et les méthodes de fluorescence⁷, sont difficiles à atteindre une résolution unique.

Nous avons développé le double test de règle d’ADN qui peut déterminer de façon unique les positions d’entrée et de sortie de l’ARNm découvert dans les complexes ribosome-mRNA.  Les ADN souverains sont des oligomères de l’ADN qui forment des duplex de certains nombres de paires de base (bp) avec l’ARNm découvert par le ribosome, quelle que soit l’extrémité de l’ARNm. Les nombres de bp révèlent alors précisément la position de ribosome sur l’ARNm pendant la translocation. Les nombres de bp des duplex sont déterminés par leurs forces critiques de dissociation obtenues à partir de la spectroscopie de magnétisation résiduelle induite par la force (FIRMS)⁸. Avec l’incertitude de la force de 2-3 pN, les forces critiques sont suffisantes pour offrir la résolution simple-nt. En mettant en œuvre une molécule de liaison sur les règles d’ADN, le côté stérilement entravé de l’ARNm par le ribosome peut être sondé. Différents déplacements ribosomal peuvent ainsi être résolus avec précision. Nous avons avec succès révélé une conformation unique en boucle de l’ARNm piégé par les antibiotiques au cours de la translocation⁹, et résolu différents cadres de lecture qui coexistaient sur une séquence d’ARNm glissante¹⁰. Cet article décrit les détails de l’essai de règle double, qui incluent la préparation des complexes de ribosome, la fonctionnalisation de surface des glissières en verre, l’immobilisation des complexes de ribosome et leur hybridation avec la règle magnétiqued d’ADN molécules, la détection magnétique et l’analyse du spectre de force par firms.