Summary

Интравитальная визуализация интраэпителиальных лимфоцитов в Murine Small Intestine

Published: June 24, 2019
doi:

Summary

Мы описываем метод визуализации GFP-маркированных IELs с помощью интравитальной визуализации тонкой кишки murine с помощью перевернутой вращающейся дискки конфокальной микроскопии. Этот метод позволяет отслеживать живые клетки в слизистой оболочке до 4 ч и может быть использован для исследования различных кишечных иммунно-эпителиальных взаимодействий.

Abstract

Интраэпителиальные лимфоциты, выражающие рецептор Т-клеток (яп. Отчасти из-за отсутствия окончательного лиганд для рецептора т-клеток, наше понимание регуляции активации IEL и их функции in vivo остается ограниченным. Это требует разработки альтернативных стратегий для изучения сигнальных путей, участвующих в регулировании функции IEL и реагирования этих клеток на местную микросреду. Хотя широко понимается, что IL ограничивают транслокацию патогенов, использование интравитальной визуализации имеет решающее значение для понимания пространственно-временной динамики взаимодействия IEL/эпителии в стабильном состоянии и в ответ на инвазивные патогены. В этом случае мы представляем протокол для визуализации мигрирующего поведения IEL в небольшой слизистой оболочке кишечника GFP и T-клеточной мыши с использованием перевернутой вращающейся дисковой конфокальной лазерной микроскопии. Хотя максимальная глубина изображения этого подхода ограничена по сравнению с использованием двухфотонных лазерно-сканирующих микроскопий, вращающийся диск конфокальной лазерной микроскопии обеспечивает преимущество высокоскоростного приобретения изображения с уменьшенным фотоотбелением и фотоповреждения. Использование 4D программного обеспечения для анализа изображений, поведение наблюдения Т-клеток и их взаимодействие с соседними клетками могут быть проанализированы после экспериментальных манипуляций, чтобы обеспечить дополнительную информацию об активации IEL и функции в слизистой оболочке кишечника.

Introduction

Интраэпителиальные лимфоциты (IEL) расположены в кишечном эпителии, и находятся как вдоль мембраны подвала и между соседними эпителиальными клетками в боковом межклеточном пространстве1. Существует примерно один IEL на каждые 5-10 эпителиальных клеток; эти IELs служат в качестве часовых для обеспечения иммунного наблюдения за большим пространством кишечного эпителиального барьера2. IEl, выражающий рецептор т-клеток (TCR), составляют до 60% от общей численности IEL в тонкой кишке мурин. Исследования на Т-клеточных недостаточномых мышах демонстрируют в значительной степени защитную роль этих клеток в ответ на кишечные травмы, воспаление и инфекцию3,4,5. Несмотря на поколение Tcrd нокаут мыши6, наше понимание биологии IEL остается ограниченным, отчасти из-за того, что лиганды, признанные TCR еще предстоит определить7. В результате, отсутствие инструментов для изучения этой популяции клеток затрудняет изучение роли активации ТКР и функционирования в физиологических и патологических условиях. Чтобы восполнить этот пробел, мы разработали живые методы визуализации для визуализации миграционного поведения и взаимодействия с соседними энтероцитами в качестве средства для получения дополнительного анализа функции IEL и отзывчивости внешних стимулов in vivo.

За последнее десятилетие, интравитальная визуализация значительно расширила наше понимание молекулярных событий, участвующих в нескольких аспектах кишечной биологии, в том числе эпителиальной клетки пролить8, регулирование эпителиальной функции барьера9 ,10, миелоидные клетки выборки содержания светила11,12, и принимающей-микроб взаимодействия11,13,14,15,16 . В контексте биологии IEL, использование интравитальной микроскопии пролило свет на пространственно-временной динамики подвижности IEL и факторы, посредничающие их поведение наблюдения13,14,15, 16. Развитие TcrdH2BeGFP (TcrdEGFP) репортер мышей, который этикетки IELs по ядерной gFP выражение17, показал, что IL являются весьма motile в эпителии и проявлять уникальное поведение наблюдения, что реагирует на микробные инфекция17,13,14. Недавно была разработана еще одна мышь-репортер t(Tcrd-GDL), которая выражает GFP в цитоплазме, чтобы обеспечить визуализацию всей ячейки18. Аналогичная методология была использована для исследования потребности конкретных рецепторов хемокина, таких как G белковых рецепторов (GPCR)-18 и -55, на динамике подвижности IEL19,20. В отсутствие клеточного репортера флуоресцентные конъюгированные антитела против CD8 были использованы для визуализации и отслеживания подвижности IEL in vivo19,20. Хотя двухфотонная лазерная сканирующая микроскопия обычно используется для интравитальной визуализации, использование вращающейся дисковой конфокальной лазерной микроскопии обеспечивает уникальные преимущества для захвата высокоскоростных и высокопроизводительных многоканальных изображений с минимальным фоновым шумом. Эта технология идеально подходит для выяснения пространственно-временной динамики иммунных/эпителиальных взаимодействий в сложной микросреде слизистой оболочки кишечника. Кроме того, с помощью различных трансгенных и / или нокаут мыши модели, эти исследования могут обеспечить понимание молекулярной регуляции иммунной и /или эпителиальной функции клеток.

Protocol

Все исследования были проведены в Ассоциации оценки и аккредитации лабораторных животных уход (AALAC) аккредитованных объекта в соответствии с протоколами, утвержденными Ратгерс Нью-Джерси Медицинская школа сравнительной медицины ресурсов. 1. Подготовка мыши <p class="jove_conte…

Representative Results

Используя интравитальную визуализацию мышей-репортеров TcrdEGFP, мы ранее показали, что «IELs» демонстрируют динамическое поведение наблюдения, в котором они патрулируют эпителий, мигрируя по мембране подвала и в боковое межклеточное пространство (LIS) на устойчивом состояние(ри?…

Discussion

Развитие методов интравитальной микроскопии дало беспрецедентную возможность наблюдатьреорганизацию субклеточных структур 8,9,22,клеточных взаимодействий12, 25 и клеточного миграционного поведения<sup cla…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Эта работа поддерживается NIH R21 AI143892, Нью-Джерси Фонд здравоохранения Грант, Буш биомедицинских Грант (KLE). Мы благодарим Мадлен Ху за помощь в редактировании рукописи и предоставлении данных, показанных в репрезентативных результатах.

Materials

35mm dish, No. 1.5 Coverslip MatTek P35G-1.5-14-C
Alexa Fluor 633 Hydrazide Invitrogen A30634
BD PrecisionGlide Hypodermic needles – 27g Thermo Fisher Scientific 14-826-48
BD Slip Tip Sterile Syringe – 1 ml Thermo Fisher Scientific 14-823-434
BD Tuberculin Syringe Thermo Fisher Scientific 14-829-9
Dissecting scissors Thermo Fisher Scientific 08-940
Electrocautery Thermo Fisher Scientific 50822501
Enclosed incubation chamber OKOLAB Microscope
Eye Needles, Size #3; 1/2 Circle, Taper Point, 12 mm Chord Length Roboz RS-7983-3
Hank's Balanced Salt Solution Sigma-Aldrich 55037C
Hoechst 33342 Invitrogen H3570
Imaris (v. 9.2.1) with Start, Track, XT modules Bitplane Software
Inverted DMi8 Leica Microscope
IQ3 (v. 3.6.3) Andor Software
Ketamine Putney Anesthesia
Kimwipes VWR 21905-026
McPherson-Vannas scissors 3” (7.5 cm) Long 5X0.15mm Straight Sharp Roboz RS-5600
Non-absorbable surgical suture, Silk Spool, Black Braided Fisher Scientific NC0798934
Nugent Forceps 4.25” (11 cm) Long Angled Smooth 1.2mm Tip Roboz RS-5228
Puralube Vet Ointment Dechra Lubricating Eye Ointment
Spinning disk Yokogawa CSU-W1 with a 63x 1.3 N.A. HC PLAN APO glycerol immersion objective, iXon Life 888 EMCCD camera, 405 nm diode laser, 488 nm DPSS laser, 640 nm diode laser Andor Confocal system
Xylazine Akorn Anesthesia

Referências

  1. Cheroutre, H., Lambolez, F., Mucida, D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes. Nature Reviews Immunology. 11 (7), 445-456 (2011).
  2. Hu, M. D., Edelblum, K. L. Sentinels at the frontline: the role of intraepithelial lymphocytes in inflammatory bowel disease. Current Pharmacology Reports. 3 (6), 321-334 (2017).
  3. Chen, Y., Chou, K., Fuchs, E., Havran, W. L., Boismenu, R. Protection of the intestinal mucosa by intraepithelial gamma delta T cells. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (22), 14338-14343 (2002).
  4. Swamy, M., et al. Intestinal intraepithelial lymphocyte activation promotes innate antiviral resistance. Nature Communications. 6, 7090 (2015).
  5. Dalton, J. E., et al. Intraepithelial gammadelta+ lymphocytes maintain the integrity of intestinal epithelial tight junctions in response to infection. Gastroenterology. 131 (3), 818-829 (2006).
  6. Mombaerts, P., et al. Spontaneous development of inflammatory bowel disease in T cell receptor mutant mice. Cell. 75 (2), 274-282 (1993).
  7. Willcox, B. E., Willcox, C. R. gammadelta TCR ligands: the quest to solve a 500-million-year-old mystery. Nature Immunology. 20 (2), 121-128 (2019).
  8. Marchiando, A. M., et al. The epithelial barrier is maintained by in vivo tight junction expansion during pathologic intestinal epithelial shedding. Gastroenterology. 140 (4), e1201-e1202 (2011).
  9. Marchiando, A. M., et al. Caveolin-1-dependent occludin endocytosis is required for TNF-induced tight junction regulation in vivo. Journal of Cell Biology. 189 (1), 111-126 (2010).
  10. Yu, D., et al. MLCK-dependent exchange and actin binding region-dependent anchoring of ZO-1 regulate tight junction barrier function. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 107 (18), 8237-8241 (2010).
  11. Chieppa, M., Rescigno, M., Huang, A. Y., Germain, R. N. Dynamic imaging of dendritic cell extension into the small bowel lumen in response to epithelial cell TLR engagement. Journal of Experimental Medicine. 203 (13), 2841-2852 (2006).
  12. McDole, J. R., et al. Goblet cells deliver luminal antigen to CD103+ dendritic cells in the small intestine. Nature. 483 (7389), 345-349 (2012).
  13. Edelblum, K. L., et al. Dynamic migration of gammadelta intraepithelial lymphocytes requires occludin. Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 109 (18), 7097-7102 (2012).
  14. Edelblum, K. L., et al. gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Migration Limits Transepithelial Pathogen Invasion and Systemic Disease in Mice. Gastroenterology. 148 (7), 1417-1426 (2015).
  15. Hu, M. D., et al. Epithelial IL-15 Is a Critical Regulator of gammadelta Intraepithelial Lymphocyte Motility within the Intestinal Mucosa. Journal of Immunology. 201 (2), 747-756 (2018).
  16. Hoytema van Konijnenburg, D. P., et al. Intestinal Epithelial and Intraepithelial T Cell Crosstalk Mediates a Dynamic Response to Infection. Cell. 171 (4), 783-794 (2017).
  17. Prinz, I., et al. Visualization of the earliest steps of gammadelta T cell development in the adult thymus. Nature Immunology. 7 (9), 995-1003 (2006).
  18. Sandrock, I., et al. Genetic models reveal origin, persistence and non-redundant functions of IL-17-producing gammadelta T cells. Journal of Experimental Medicine. 215 (12), 3006-3018 (2018).
  19. Wang, X., Sumida, H., Cyster, J. G. GPR18 is required for a normal CD8alphaalpha intestinal intraepithelial lymphocyte compartment. Journal of Experimental Medicine. 211 (12), 2351-2359 (2014).
  20. Sumida, H., et al. GPR55 regulates intraepithelial lymphocyte migration dynamics and susceptibility to intestinal damage. Sci Immunol. 2 (18), (2017).
  21. Ewald, A. J., Werb, Z., Egeblad, M. Monitoring of vital signs for long-term survival of mice under anesthesia. Cold Spring Harbor Protocols. 2 (2), (2011).
  22. Watson, A. J., et al. Epithelial barrier function in vivo is sustained despite gaps in epithelial layers. Gastroenterology. 129 (3), 902-912 (2005).
  23. Lodolce, J. P., et al. IL-15 receptor maintains lymphoid homeostasis by supporting lymphocyte homing and proliferation. Immunity. 9 (5), 669-676 (1998).
  24. Ma, L. J., Acero, L. F., Zal, T., Schluns, K. S. Trans-presentation of IL-15 by intestinal epithelial cells drives development of CD8alphaalpha IELs. Journal of Immunology. 183 (2), 1044-1054 (2009).
  25. Knoop, K. A., et al. Antibiotics promote the sampling of luminal antigens and bacteria via colonic goblet cell associated antigen passages. Gut Microbes. 8 (4), 400-411 (2017).
  26. Sujino, T., et al. Tissue adaptation of regulatory and intraepithelial CD4(+) T cells controls gut inflammation. Science. 352 (6293), 1581-1586 (2016).
  27. Zhang, B., et al. Differential Requirements of TCR Signaling in Homeostatic Maintenance and Function of Dendritic Epidermal T Cells. Journal of Immunology. 195 (9), 4282-4291 (2015).
  28. Chennupati, V., et al. Intra- and intercompartmental movement of gammadelta T cells: intestinal intraepithelial and peripheral gammadelta T cells represent exclusive nonoverlapping populations with distinct migration characteristics. Journal of Immunology. 185 (9), 5160-5168 (2010).
  29. Kolesnikov, M., Farache, J., Shakhar, G. Intravital two-photon imaging of the gastrointestinal tract. Journal of Immunological Methods. 421, 73-80 (2015).

Play Video

Citar este artigo
Jia, L., Edelblum, K. L. Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine. J. Vis. Exp. (148), e59853, doi:10.3791/59853 (2019).

View Video