Summary

Análisis experimental del engulfment de thymocyte Apopético por los macrófagos

Published: May 24, 2019
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Summary

Aquí presentamos un protocolo para preparar los timocitos apopónticos y los macrófagos peritoneal y analizar la eficiencia de la efervocitosis y el bloqueo específico por inhibidores de los timocitos apopónticos. Este protocolo tiene una amplia aplicación en el aclaramiento mediado por células de otras partículas, incluyendo granos artificiales y bacterias.

Abstract

La apoptosis celular es un proceso natural y desempeña un papel crítico en el desarrollo embrionario, la regulación homeostática, la inducción de la tolerancia inmune y la resolución de la inflamación. La acumulación de desechos apopónticos en el cuerpo puede desencadenar respuestas inflamatorias crónicas que conducen a enfermedades autoinmunes sistémicas con el tiempo. El aclaramiento de células apopónticas deterioradas se ha implicado en una variedad de enfermedades autoinmunes. El aclaramiento apopético es un proceso complejo que raramente se detecta en condiciones fisiológicas. Implica abundantes receptores de superficie y moléculas de señalización. El estudio del proceso de aclaramiento de la célula apopéctica proporciona mecanismos moleculares perspicaces y subsiguientes respuestas biológicas, que pueden conducir al desarrollo de nuevas terapias. Aquí describimos los protocolos para la inducción de los timocitos apopónticos, la preparación de los macrófagos peritoneales y el análisis del aclaramiento de las células apopónticas por citometría de flujo y microscopía. Todas las células se someten a la apoptosis en una cierta etapa, y muchas células residenciales y circulantes pueden captación de desechos apopético. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí se puede utilizar en muchas aplicaciones para caracterizar la Unión de la célula apopóntica y la ingestión por muchos otros tipos de células.

Introduction

Nuestro cuerpo genera 1-10 mil millones de células apopónticas sobre una base diaria. Se debe borrar un número tan grande de células apopónticas de manera que las respuestas inmunitarias permanezcan en reposo. Para asegurar el aclaramiento de las células apopónticas de manera oportuna, numerosos tipos de células residentes de tejido y células circulantes desarrollan mecanismos para engullir las células apopónticas1. Regulación disfuncional de la apoptosis se ha implicado en la aparición y progresión de diversas enfermedades inflamatorias y autoinmunidad2. La apoptosis también desempeña un papel crítico en la patogénesis del desarrollo del cáncer y su posterior resistencia a los tratamientos convencionales3,4. La eliminación de las células apopónticas generalmente promueve una respuesta antiinflamatoria, que puede estar relacionada con la tolerancia inmunológica5. La alteración del aclaramiento de las células apopónticas impulsa la autoinmunización y contribuye al desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas tanto en humanos como en ratones6.

Cuando las células se someten a la apoptosis, exponen la fosfatidilserina (PtdSer) desde el prospecto interno hasta el prospecto externo de la membrana. El PtdSer será reconocido por los fagocitos a través de los receptores de la superficie. Se han identificado más de una docena de receptores para reconocer y/o facilitar el internalización de las células apopónticas. En general, hay al menos tres tipos de receptores de superficie implicados en el aclaramiento de la célula apopóntica: receptores tethering, reconocer las células apopónticas; receptores de cosquillas, iniciar el engulfment; receptores de Chaperos, facilitan todo el proceso7. Los receptores de tirosina quinasas TAM (TAM RTKs) constan de Tyro-3, AXL y MER y se expresan principalmente por células mieloide del sistema inmunitario8. La función principal de TAM RTKs es servir como receptores de tethering, facilitando la eliminación fagocitaria de células apopónticas y escombros. Nuestro grupo ha estudiado el aclaramiento de células apopécticas mediadas en el entorno de autoinmunidad durante muchos años. El crecimiento proteico dependiente de la vitamina K, proteína específica 6 (Gas6) y proteína S (pros) se une y activa los receptores TAM9,10. Gas6 se produce en el corazón, los riñones y los pulmones. ProS se produce principalmente en el hígado11. TAM reconoce las células apopónticas de tal manera que la terminal N de Gas6/ProS se une al PtdSer en una célula apopéctica y el terminal C de Gas6/ProS se une a los receptores TAM que anclaron en la superficie de los fagocitos. Junto con los otros receptores, el internalización de las células apopónticas se produce12. Aunque Mer puede unirse a los ligandos ProS y Gas6, descubrimos que Gas6 parece ser el ligando único para la fagocitosis de macrófagos mediada por Mer de las células apopónticas, que pueden ser bloqueadas por el anticuerpo anti-Mer13. Los macrófagos son fagocitos profesionales. El aclaramiento rápido de las células apopónticas por macrófagos es importante para la inhibición de la inflamación y las respuestas autoinmunes contra antígenos intracelulares. El receptor de la tirosina quinasa del Mer es crítico para el internalización del macrófago y el aclaramiento eficiente de las células apopónticas14. En el bazo del ratón, Mer expresa principalmente en la zona marginal y los macrófagos corporales tangibles13.

El protocolo presentado aquí describe un método básico para inducir la apoptosis celular y demostrar maneras de medir el proceso y la eficiencia de la efervocitosis. Estos protocolos pueden ser fácilmente adaptados para estudiar la efferocitosis por otros tipos de células en el internalización de las células apopónticas de diferentes orígenes.

Protocol

Ratones experimentales fueron criados y mantenidos en nuestra colonia de ratones. Todo el trabajo en animales se llevó a cabo de acuerdo con las pautas del Comité institucional de cuidado y uso de animales (IACUC) de la Universidad de Cincinnati. 1. preparación de los timocitos apopónticos etiquetados como CFSE Eutanasia dos ratones C57/B6 ingenuos por inhalación de CO2 durante 10 min y diseccionar para abrir la cavidad torácica, remover (extraer) el timo con fórcep…

Representative Results

Análisis de la enfaración peritoneal de los timocitos apópticos por macrófagos. Los macrófagos y las células apopónticas peritoneal se prepararon y cocultivaron como se describe en el protocolo. Los macrófagos fueron separados y manchados con el anticuerpo anti-CD11b de PE conjugada durante 20 min en hielo. Los macrófagos fueron lavados y procesados en un CITOMETRO de flujo. Como se ve, no hay macrófago positivo de CFSE en el cuadrante inferior derecho cuando no se agregaron células apopóntic…

Discussion

La apoptosis es un proceso de muerte celular altamente conservado que involucra muchas cascadas de señal e induce la expresión de proteínas, secreción, y el transporte. La apoptosis se asocia a menudo con los cambios de morfología celular17. Las células apopónticas liberan activamente citocinas y quimioquinas que atraen a los fagocitos para emigrar al sitio e iniciar el proceso de engulfment, una vía extremadamente compleja bajo control estricto18. Por otro lado, la…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

La investigación en el laboratorio de Shao es apoyada por la investigación de premio innovador de la Facultad de medicina y el Premio de piloto de la Facultad Junior del Departamento de medicina interna, Universidad de Cincinnati y Grant DK K01_095067 de NIDDK/NIH.

Materials

Ack lysing buffer GIBCO A10492
Annexin V/7-AAD BD Pharmingen 559763
Anti-Mer antibody R&D Systems BAF591
CD11b-PE (clone M1/70) BD Pharmingen 553311
CFSE Invitrogen C1157
DMSO Sigma-Aldrich D-2650
EDTA (0.5 mM) GIBCO 15575-020
FACS tubes BD Biosciences 352017
Frosted slides Fisher Scientific 12-552-343
Horse Serum (Heat-inactivated) Invitrogen 26050088
Lidocaine Sigma-Aldrich L-5647 Prepare 1% buffer in 1x PBS
PBS, 1x Corning 21040CV
RPMI-1640 Corning 10040CV
RXDX-106 Selleck Chemicals CEP-40783
Staurosprine (100mg) Fisher Scientific BP2541-100 Add 214.3 ml of DMSO into 100mg to make 1mM stocking solution
Thioglycolate Medium Brewer Modified BD Biosciences 243010 Prepare 3% thioglycolate buffer in 1´PBS, autoclaved, and store in the dark for 3 months.

Referências

  1. Shao, W. H., Cohen, P. L. Disturbances of apoptotic cell clearance in systemic lupus erythematosus. Arthritis Research and Therapy. 13 (1), 202 (2011).
  2. Cohen, P. L. Apoptotic cell death and lupus. Springer Seminars in Immunopathology. 28 (2), 145-152 (2006).
  3. Wong, R. S. Apoptosis in cancer: from pathogenesis to treatment. Journal of Experimental and Clinical Cancer Research. 30, 87 (2011).
  4. Baig, S., et al. Potential of apoptotic pathway-targeted cancer therapeutic research: Where do we stand. Cell Death and Disease. 7, 2058 (2016).
  5. Poon, I. K., Lucas, C. D., Rossi, A. G., Ravichandran, K. S. Apoptotic cell clearance: basic biology and therapeutic potential. Nature Reviews Immunology. 14 (3), 166-180 (2014).
  6. Qian, Y., Wang, H., Clarke, S. H. Impaired clearance of apoptotic cells induces the activation of autoreactive anti-Sm marginal zone and B-1 B cells. Journal of Immunology. 172 (1), 625-635 (2004).
  7. Hawkins, L. A., Devitt, A. Current understanding of the mechanisms for clearance of apoptotic cells-a fine balance. Journal of Cell Death. 6, 57-68 (2013).
  8. Lemke, G. Biology of the TAM receptors. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (11), 009076 (2013).
  9. Stitt, T. N., et al. The anticoagulation factor protein S and its relative, Gas6, are ligands for the Tyro 3/Axl family of receptor tyrosine kinases. Cell. 80 (4), 661-670 (1995).
  10. Linger, R. M., Keating, A. K., Earp, H. S., Graham, D. K. TAM receptor tyrosine kinases: biologic functions, signaling, and potential therapeutic targeting in human cancer. Advances in Cancer Research. 100, 35-83 (2008).
  11. van der Meer, J. H., van der Poll, T., van ‘T Veer, C. TAM receptors, Gas6, and protein S: roles in inflammation and hemostasis. Blood. 123 (16), 2460-2469 (2014).
  12. Lemke, G., Burstyn-Cohen, T. TAM receptors and the clearance of apoptotic cells. Annal of the New York Academy of Sciences. 1209, 23-29 (2010).
  13. Shao, W. H., Zhen, Y., Eisenberg, R. A., Cohen, P. L. The Mer receptor tyrosine kinase is expressed on discrete macrophage subpopulations and mainly uses Gas6 as its ligand for uptake of apoptotic cells. Clinical Immunology. 133 (1), 138-144 (2009).
  14. Scott, R. S., et al. Phagocytosis and clearance of apoptotic cells is mediated by MER. Nature. 411 (6834), 207-211 (2001).
  15. Klarquist, J., Janssen, E. M. The bm12 Inducible Model of Systemic Lupus Erythematosus (SLE) in C57BL/6 Mice. Journal of Visualized Experiment. (105), e53319 (2015).
  16. Malawista, A., Wang, X., Trentalange, M., Allore, H. G., Montgomery, R. R. Coordinated expression of tyro3, axl, and mer receptors in macrophage ontogeny. Macrophage (Houst). 3, (2016).
  17. Elmore, S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicologic Pathology. 35 (4), 495-516 (2007).
  18. Ravichandran, K. S. Find-me and eat-me signals in apoptotic cell clearance: progress and conundrums. Journal of Experimental Medicine. 207 (9), 1807-1817 (2010).
  19. Rock, K. L., Kono, H. The inflammatory response to cell death. Annual Review in Pathology. 3, 99-126 (2008).
  20. Roberts, K. M., Rosen, A., Casciola-Rosen, L. A. Methods for inducing apoptosis. Methods in Molecular Medicine. 102, 115-128 (2004).
  21. Progatzky, F., Dallman, M. J., Lo Celso, C. From seeing to believing: labelling strategies for in vivo cell-tracking experiments. Interface Focus. 3 (3), 20130001 (2013).
  22. Stijlemans, B., et al. Development of a pHrodo-based assay for the assessment of in vitro and in vivo erythrophagocytosis during experimental trypanosomosis. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (3), 0003561 (2015).
  23. Hochreiter-Hufford, A., Ravichandran, K. S. Clearing the dead: apoptotic cell sensing, recognition, engulfment, and digestion. Cold Spring Harbor Perspective in Biology. 5 (1), 008748 (2013).
  24. Chen, S., So, E. C., Strome, S. E., Zhang, X. Impact of Detachment Methods on M2 Macrophage Phenotype and Function. Journal of Immunology Methods. 426, 56-61 (2015).
  25. Fleit, S. A., Fleit, H. B., Zolla-Pazner, S. Culture and recovery of macrophages and cell lines from tissue culture-treated and -untreated plastic dishes. Journal of Immunology Methods. 68 (1-2), 119-129 (1984).
  26. Fine, N., Barzilay, O., Glogauer, M. Analysis of Human and Mouse Neutrophil Phagocytosis by Flow Cytometry. Methods Molecular Biology. 1519, 17-24 (2017).
  27. Summers, C., et al. Neutrophil kinetics in health and disease. Trends in Immunology. 31 (8), 318-324 (2010).
  28. Dale, D. C., Boxer, L., Liles, W. C. The phagocytes: neutrophils and monocytes. Blood. 112 (4), 935-945 (2008).

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Citar este artigo
Zhen, Y., Shao, W. Experimental Analysis of Apoptotic Thymocyte Engulfment by Macrophages. J. Vis. Exp. (147), e59731, doi:10.3791/59731 (2019).

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