Renal Subcapsular transplantasjon av 2 '-Deoxyguanosine-behandlet murine embryonale thymus i Nude mus
Summary
Vi tilbyr en enkel og effektiv metode for å transplantere 2 ‘-deoxyguanosine behandlet E 18.5 thymus i nyre kapselen til en naken mus. Denne metoden bør aide i studiet av både tymusatrofi epitelceller funksjon og T-celler modning.
Abstract
Den thymus er en viktig sentral immun organ, som spiller en viktig rolle i utviklingen og differensiering av T-celler. Thymus transplantasjon er en viktig metode for å undersøke tymusatrofi epitel celle funksjon og T-celler modning in vivo. Her vil vi beskrive de eksperimentelle metodene som brukes i vårt laboratorium for å transplantere 2 ‘-deoxyguanosine (å tømme donor ‘ s lymfocytter) behandlet embryonale thymus i nyre kapsel av en athymic naken mus. Denne metoden er både enkel og effektiv og krever ikke spesielle ferdigheter eller enheter. Resultatene oppnås via denne enkle metoden viste at transplanterte thymus kan effektivt støtte mottakerens T-celler produksjon. I tillegg vil flere viktige punkter med hensyn til protokollen bli ytterligere belyst.
Introduction
Thymus er den sentrale immun organ, innenfor thymus thymocytes gjennomgår positive og negative valg, og blir modne T celler1,2. Unormal positiv eller negativ markering resulterer i immunsvikt eller autoimmune sykdommer henholdsvis3,4. Derfor er thymus organ transplantasjon en viktig tilnærming for å studere prosessen med T celler utvalg i donor ‘ s thymus. Denne metoden er spesielt viktig når analysere tymusatrofi epitel funksjon formidlet av genet mutasjoner som forårsaker embryonale dødelige fenotype når mutert5.
For å studere modning av en mottakers T-celler i den transplanterte thymus, forringelse av donor ‘ s lymfocytter i thymus er nødvendig. For dette formålet, embryonale 14-, 15-eller 16-dagers (E14, E15, E16) thymus er vanligvis valgt6,7. Thymus fra mer modne stadier kan også være vellykket utarmet av donor ‘ s lymfocytter ved å behandle med 2 ‘-deoxyguanosine. Men en detaljert protokoll for tappe lymfocytter og bruk av eldre thymus kultur har ikke tidligere blitt beskrevet8,9. Mens transplantasjon protokoller har blitt innført av flere studier10,11, ytterligere modifisering og forbedring av disse protokollene er nødvendig.
Vår protokoll er delt inn i to deler: (i) nedbryting av T-lymfocytter fra slutten av utviklingsfasen E 18.5 thymus av kulturen i 2 ‘-deoxyguanosine-inneholder medier. (II) transplantasjon av den kultivert thymus i mottakerne. I denne prosedyren, utviklet vi en enkel måte å levere det store vevet (E 18.5 thymus) i nyre kapselen med redusert sjanse for nyreskader. Mens fokus på senere stadium thymus, kan vår protokoll også brukes direkte eller med modifikasjoner for transplantasjon av thymus på ulike utviklingsmessige stadier eller andre lignende størrelse vev.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nyre subcapsular transplantasjon av embryonale thymus er en viktig metode for å studere tymusatrofi epitelceller funksjon og prosessen med T celler modning in vivo. Selv om det er flere eksperimentelle studier på embryonale thymus orgel kultur og transplantasjon6,7, vår protokoll gir en enkel alternativ prosedyre på murine embryonale thymus kultur og renal subcapsular transplantasjon for eldre thymus vev.
Vår protokoll forbedrer p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av Start Package av Jinan University til S.J. og ved Science and Technology program of Guangzhou Kina (Grant no. 201704020209 til S.J.). Vi takker Amy Botta (Department of Biology, York University, Toronto, ON M3J 1P3, Canada) for korrekturlesing og redigering av manuskriptet.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
Referências
- Klein, L., Kyewski, B., Allen, P. M., Hogquist, K. A. Positive and negative selection of the T cell repertoire: what thymocytes see (and don’t see). Nature Reviews Immunology. 14, 377-391 (2014).
- Hogquist, K. A., Baldwin, T. A., Jameson, S. C. Central tolerance: learning self-control in the thymus. Nature Reviews Immunology. 5, 772-782 (2005).
- Spits, H., Touraine, J. L., Yssel, H., de Vries, J. E., Roncarolo, M. G. Presence of host-reactive and MHC-restricted T cells in a transplanted severe combined immunodeficient (SCID) patient suggest positive selection and absence of clonal deletion. Immunological Reviews. 116, 101-116 (1990).
- Nagamine, K., et al. Positional cloning of the APECED gene. Nature Genetics. 17, 393-398 (1997).
- Yanagihara, T., et al. Intronic regulation of Aire expression by Jmjd6 for self-tolerance induction in the thymus. Nature Communications. 6 (8820), (2015).
- Jenkinson, W., Jenkinson, E., Anderson, G. Preparation of 2-dGuo-Treated Thymus Organ Cultures. Journal of Visualized Experiments. (18), (2008).
- Bosselut, R., Vacchio, M. S. . T-Cell Development: Methods and Protocols. , (2016).
- Anderson, M. S., et al. Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein. Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).
- Takaba, H., et al. Fezf2 Orchestrates a Thymic Program of Self-Antigen Expression for Immune Tolerance. Cell. 163 (4), 975-987 (2015).
- Morillon, Y. M. 2. n. d., Manzoor, F., Wang, B., Tisch, R. Isolation and transplantation of different aged murine thymic grafts. Journal of Visualized Experiments. (99), e52709 (2015).
- Caetano, S. S., Teixeira, T., Tadokoro, C. E. Intravital imaging of the mouse thymus using 2-photon Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (59), e3504 (2012).
- JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. Lab Animal Research. , (2019).
- Gierl, M. S., Karoulias, N., Wende, H., Strehle, M., Birchmeier, C. The zinc-finger factor Insm1 (IA-1) is essential for the development of pancreatic beta cells and intestinal endocrine cells. Genes & Development. 20 (17), 2465-2478 (2006).
- Tao, W., et al. Haploinsufficiency of Insm1 Impairs Postnatal Baseline β-Cell Mass. Diabetes. 67 (12), 2615-2625 (2018).
