Trasplante subcapsular renal de timo embrionario murino tratado con 2'-desoxiguanosina en ratones desnudos
Summary
Proporcionamos un método simple y eficiente para trasplantar 2′-deoxyguanosine tratado E18.5 timo en la cápsula renal de un ratón desnudo. Este método debe ser un iida en el estudio de la función de células epiteliales timmicas y la maduración de las células T.
Abstract
El timo es un importante órgano inmune central, que desempeña un papel esencial en el desarrollo y diferenciación de los células T. El trasplante de timo es un método importante para investigar la función de las células epiteliales timmicas y la maduración in vivo de las células T. Aquí describiremos los métodos experimentales utilizados dentro de nuestro laboratorio para trasplantar 2′-deoxyguanosina (para agotar los linfocitos del donante) timo embrionario tratado en la cápsula renal de un ratón desnudo atímico. Este método es simple y eficiente y no requiere habilidades o dispositivos especiales. Los resultados obtenidos a través de este sencillo método mostraron que el timo trasplantado puede apoyar eficazmente la producción de células T del receptor. Además, se aclararán varios puntos clave con respecto al protocolo.
Introduction
El timo es el órgano inmune central, dentro del timo timi citocitos se someten a una selección positiva y negativa, y se convierten en células T maduras1,2. La selección positiva o negativa anormal da como resultado inmunodeficiencias o patologías autoinmunes respectivamente3,4. Por lo tanto, el trasplante de órganos de timo es un enfoque importante para estudiar el proceso de selección de células T en el timo del donante. Este método es particularmente crucial cuando se analiza la función epitelial timmica mediada por mutaciones genéticas que causan fenotipo letal embrionario cuando se muta5.
Para estudiar la maduración de las células T de un receptor en el timo trasplantado, es necesario agotar los linfocitos del donante dentro del timo. Para ello, el timo embrionario de 14, 15 o 16 días (E14, E15, E16) se selecciona generalmente6,7. El timo de etapas más maduras también se puede agotar con éxito de los linfocitos del donante mediante el tratamiento con 2′-deoxyguanosina. Sin embargo, un protocolo detallado para agotar linfocitos y el uso del cultivo de timo más antiguo no se ha descrito previamente8,9. Si bien los protocolos de trasplante han sido introducidos por varios estudios10,11, es necesario modificar y mejorar aún más estos protocolos.
Nuestro protocolo se divide en dos partes: (i) Agotamiento de linfocitos T de la etapa de desarrollo tardío E18.5 timo por cultivo en medios que contienen 2′-deoxyguanosine. (ii) Trasplante del timo cultivado en recipientes. En este procedimiento, desarrollamos una manera sencilla de administrar el tejido grande (E18.5 timo) en la cápsula renal con menor probabilidad de lesión renal. Mientras se centra en el timo de etapa posterior, nuestro protocolo también se puede utilizar directamente o con modificaciones para el trasplante de timo en varias etapas del desarrollo u otros tejidos de tamaño similar.
Protocol
Representative Results
Discussion
El trasplante subcapsular renal del timo embrionario es un método importante para estudiar la función de las células epiteliales timmicas y el proceso de maduración de las células T in vivo. Aunque existen varios estudios experimentales sobre cultivo deórganos de timo embrionario y trasplante 6,7, nuestro protocolo proporciona un procedimiento alternativo simple sobre el cultivo del timo embrionario murino y subcapsular renal trasplante para tejido timo má…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Paquete De Inicio de la Universidad Jinan a S.J. y por el Programa de Ciencia y Tecnología de Guangzhou China (Grant No. 201704020209 a S.J.). Agradecemos a Amy Botta (Departamento de Biología, Universidad de York, Toronto, ON M3J 1P3, Canadá) por la corrección y edición del manuscrito.
Materials
| 0.5% Povidone iodine | Shanghai Likang Distinfectant Hi-Tech Co.Ltd | 20171113 | |
| 0.9% Sodium Chloride Injection | Shandong Qilu Pharmaceuyical Co.Ltd | 2C17112101 | |
| 1 mL Sterile syringe | Solarbio | YA1090 | |
| 2’-Deoxyguanosine | MEC | HY-17563 | 1M in DMSO, 1:800 using (final 1.25mM) |
| 24 Well Plate | Corning Incorporated | Costar 3524 | |
| 4-0 Surgical suture needles with thread | NingBo Cheng-He Microsurgical Instruments Factory China | YY0166-2002 | |
| 60mm Cell Culture Dish | Corning Incorporated | 430166 | |
| 70% ETOH | LIRCON | 20181221 | |
| APC anti-mouse CD8a antibodies | Biolegend | 100711 | 1:100 |
| Bent-tip fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1060 | To sterilize before use |
| Cefmetazole Sodium for Injection | Sichuan Hexin Pharmaceutical co,Ltd | 17062111 079 | 6mg in 0.5ml 0.9% NaCl solution, 7.5ul/g body weight |
| Dissecting scissors, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JC2303 | To sterilize before use |
| Fetal bovine serum (FBS） | GIBCO | 10270-106 | |
| Fine forceps, JZ 10 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | JD1050 | To sterilize before use |
| Flow cytometry | BD | FACSCanto II | |
| Flunixin meglumine | MACLIN | F810147 | 1mg in 1ml 0.9% NaCl solution,2ul/g body weight |
| Forceps, Dumont#5 | World Precision Instruments | 14098 | To sterilize before use |
| Infrared lamp | OTLAN | MT-810 | |
| Needle holder, JZ 14 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J32010 | To sterilize before use |
| PE anti-mouse CD4 | Biolegend | 100511 | 1:100 |
| Penicillin-Streptomycin mixture | GIBCO | 15140122 | 1:100 |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | 1.5% solution in PBS, 75ug/g body weight |
| RPMI1640 Medium | GIBCO | C14-11875-093 | |
| Scalp vein needle | Shanghai Kindly Medical Instruments Co., Ltd | XC001 | |
| Spring scissors | VANNAS | S11014-12 | To sterilize before use |
| stereomicroscope | OLYMPUS | SZ61 | |
| Sterile 15cm cotton swab | Guangzhou Haozheng | 20150014 | |
| Sterile gauze 5 cm x 7 cm-8P | Guangzhou Haozheng | 20172640868 | |
| Sterile PBS (1x) | GENOM | GNM20012 | |
| Tissue forceps, JZ 12.5 cm | Shanghai Medical Devices Group Co.,Ltd. | J41010 | To sterilize before use |
Referências
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