Her præsenterer vi en protokol til at fremkalde svær TBI med lateral Fluid percussion skade (FPI) model i voksne, mandlige Wistar rotter. Vi demonstrerer også brugen af et trådløst telemetri system til at indsamle kontinuerlige video-EEG-optagelser og Monitor for epileptiforme udledninger i overensstemmelse med post-traumatisk epileptogenesis.
Den laterale Fluid percussion skade (FPI) model er veletableret og er blevet brugt til at studere TBI og post-traumatisk epilepsi (PTE). Der er imidlertid rapporteret om en betydelig variation i de specifikke parametre, der anvendes i forskellige undersøgelser, som har anvendt denne model, hvilket gør det vanskeligt at harmonisere og fortolke resultaterne mellem laboratorierne. For eksempel er variabilitet blevet rapporteret med hensyn til størrelse og placering af kraniektomi, hvordan luer Lock hub er placeret i forhold til kraniektomi, det atmosfæriske tryk anvendes på Dura og varigheden af tryk pulsen. Hver af disse parametre kan påvirke skade sværhedsgraden, som direkte korrelerer med forekomsten af PTE. Dette er blevet manifesteret som en bred vifte af dødelighed, oprettende refleks gange og hyppigheden af krampeanfald rapporteret. Her giver vi en detaljeret protokol for den metode, vi har brugt til at hjælpe med at lette harmoniseringen mellem undersøgelser. Vi brugte FPI i kombination med et trådløst EEG-telemetri system til kontinuerligt at overvåge for elektro grafiske ændringer og detektere beslaglæggelse aktivitet. FPI induceres ved at skabe en 5 mm craniektomi over den venstre halvkugle mellem Bregma og lambda og ved siden af den laterale højderyg. En luer lås hub er sikret på kraniet over craniektomi. Denne hub er forbundet til FPI-enheden, og en 20-millisekunders tryk puls leveres direkte til den intakte Dura gennem tryk slange, der er forbundet til hubben via et twist lock stik. Efter helbredelse, rotter er re-bedøvet at fjerne hubben. Fem 0,5 mm, rustfrit stål EEG elektrode skruer er placeret i kontakt med Dura gennem kraniet og fungere som fire optagelse elektroder og en referenceelektrode. Elektrode ledningerne opsamles i en sokkel stik, som er sikret på plads med knoglecement. Kontinuerlige video/EEG-optagelser indsamles i op til 4 uger efter TBI.
I en 2015 rapport til Kongressen, centre for Disease Control rapporterede, at ca 2.500.000 mennesker om året lider traumatisk hjerneskade (TBI) i USA1. Det anslås, at TBI forårsager 20% af symptomatiske epilepsier og 5% af alle epilepsier2,3,4. Desuden udvikler ca. 20% af TBI-patienterne posttraumatisk epilepsi5. Vigtigt, kronisk, tilbagevendende anfald, der opstår som følge af TBI er ofte farmakoresistant, øge byrden af sygdommen6. De nøjagtige mekanismer, der fører til posttraumatisk epilepsi (PTE), er fortsat uklare. Flere af de vigtigste epidemiologiske studier har imidlertid undersøgt incidensen og den potentielle risiko for at udvikle posttraumatisk epilepsi (Pte)2,4,7,8,9 ,10,11. Disse epidemiologiske undersøgelser har hver især forstærket korrelationen mellem skadens sværhedsgrad og risikoen for epileptogenese.
De nuværende metoder, der i udstrakt grad er blevet anvendt til at identificere nye antiepileptika, har været stærkt afhængige af modeller, der anvender kemo krampe eller elektrisk optændings midler til at fremkalde epilepsi12. I betragtning af den høje forekomst af farmako-resistens over for lægemidler, der er udviklet i disse modeller af TBI-patienter, antager vi, at TBI-induceret krampeanfald kan være forskellige fra kemo kramper eller optændings induceret krampeanfald og kan involvere forskellige veje eller processer af epileptogenese. Derfor kan en TBI model være bedre egnet til udvikling af behandlinger, der er mere effektive til at forhindre post-traumatisk epileptogenesis.
Den flydende percussion skade (FPI) model af TBI har været anvendt i årtier og er en veletableret metode til at undersøge både TBI og Pte13,14,15,16,17, 18. som vi for nylig gennemgik, er der imidlertid en høj grad af variation i de FPI-metoder, der rapporteres på tværs af laboratorier19,20. Denne manglende sammenhæng mellem laboratorierne forhindrer reproducerbarhed af prækliniske fund og gør fortolkningen af resultaterne til en udfordring. Som følge heraf er der blevet anvendt øget interesse og indsats for at opnå en større harmonisering af disse typer undersøgelser21,22,23,24.
I et forsøg på yderligere at øge sammenhængen og harmoniseringen mellem laboratorier, der fokuserer på at studere posttraumatisk epileptogenesis, giver vi her en detaljeret metodologi for vores tilgang. Vi har tidligere rapporteret en 60% forekomst af krampeanfald inden for seks uger efter svær TBI20. Vi bruger nu denne tilgang til at overvåge rotter begynder dagen for skade og løbende følge dem 24 timer i døgnet i op til 4 uger. Vi har valgt at bruge et trådløst telemetri system, som giver flere fordele. For det første, rotter er i stand til frit at bevæge sig omkring deres bur, og dermed reducerer stress. For det andet en reduktion i signal støj som rotten tjener som jorden. Derudover anvender vores nuværende system et accelerometer, som registrerer hurtige bevægelser i alle tre planer (X, Y og Z) og kan være nyttige til at identificere krampeanfald. Endelig, den trådløse telemetri system giver mulighed for lettere forvaltning af rotter såsom supplerende saltvands injektioner, vejning og gennemføre neurologiske sværhedsgrad scores, hvilket er kompliceret, når rotter er knyttet til en tether. Denne fremgangsmåde har imidlertid også flere begrænsninger. Første, de oprindelige omkostninger ved et system til at registrere fra op til otte rotter samtidig kan være i intervallet $60.000. For det andet, strøm er begrænset af en batteri kilde. Dette kræver daglig overvågning og udskiftning af batterier. Den tid, der skal bruges mellem batteriskift, kan påvirkes af samplingfrekvensen. For en prøvetagnings hastighed på 1000 Hz skiftes batterierne dog typisk en gang om ugen. Den begrænsede strømforsyning begrænser også systemet til kun at optage fra fire EEG-signaler. Endelig er signal Drop out begrænset, men forekommer lejlighedsvis. Men denne tilgang giver en konsekvent og pålidelig metode til at overvåge post-traumatisk epileptogenesis og kan støtte i identifikationen af nye terapeutiske behandlinger.
Der er rapporteret om betydelig variation mellem laboratorierne med hensyn til de specifikke parametre og metoder, der anvendes til FPI TBI model 14,26,27,28. Disse uoverensstemmelser har resulteret i modstridende resultater og gør det vanskeligt at harmonisere indsatsen og resultaterne mellem laboratorierne. Her har vi præsenteret en detaljeret metodologi, der beskriver vores tilgang til langsigtet, kontinuerlig optagelse af video/EEG til at overvåge for post-traumatisk epileptiforme aktivitet. En række trin er afgørende for at generere reproducerbare resultater med den beskrevne metode.
For det første, da forekomsten af post-traumatisk epilepsi korrelerer med skade sværhedsgrad, anvende betingelser, der resulterer i den mest alvorlige TBI. Specifikt, brug en 5 mm craniektomi for at sikre, at et tilstrækkeligt stort område af Dura er udsat. Desuden sikres en kvindelig-kvindelig luer lås enhed på overfladen af kraniet, med åbningen placeret direkte over kraniektomi. Dette adskiller sig fra andre laboratorier, der har brugt en mindre kraniektomi (3 mm) og/eller placeret en modificeret nåle hub inde i kraniektomi, som effektivt reducerer åbnings størrelsen. Ved at placere luer-låsen uden for craniektomi, opretholdes 5mm åbningen. Disse specifikke parametre påvirker den samlede kraft anvendt på Dura. Det atmosfæriske tryk, der påføres Dura, har også stor indflydelse på alvoren af den observerede skade. Desværre, atmosfærisk tryk er meget varierende og synes at være enhed afhængig. Nogle laboratorier har rapporteret at anvende en Tryk puls på 8-10 MS18. I modsætning hertil resulterer den beskrevne metode i en 20 MS tryk puls. Dette er i overensstemmelse med andre laboratorier, der synes at generere mere alvorlig skade 14,28. Det er klart, at den skade inducerende tryk impuls er en parameter, der udviser betydelig variation mellem laboratorierne og skal være empirisk defineret. Sværhedsgraden af skader kan dog bestemmes ud fra en kombination af dødelighedsrater (40-50%), oprettende refleks tider (> 30 min)26. Det er også vigtigt, at kun dyr med en intakt Dura medtages i studiet. Hertil kommer, at hvis kraniektomi er tilstoppet med lim eller cement, således at en del af Dura under kraniektomi ikke udsættes for den fulde kraft af væsketryk pulsen, skal dyret elimineres fra studiet. Desuden kan overskydende lim under luer låsen overholde dura og fjerne den med cement hætten selv efter en vellykket skade. Endelig giver den glatte form af tryk impuls kurven på oscilloskop-sporet indikation af, at der ikke er luftbobler i væske kammeret, og indikerer, at stemplet bevæger sig uden impedans.
Anæstesi er en anden kritisk faktor, der skal kontrolleres. Isoflurane eksponering skal holdes på det lavest mulige niveau for at opretholde et kirurgisk plan for anæstesi. Rotter eksponeret for højere niveauer af isofluran eller for lange varigheder er mere tilbøjelige til at udvikle Neuro GENIC-induceret lungeødem. Fremstilling af kraniet repræsenterer et andet kritisk aspekt af metoden. Især tørring af kraniet og fjernelse af knogle støv hjælper med at forhindre rotter i at fjerne senderen for tidligt.
Placering af skruer og tilslutning af EEG ledninger er naturligvis afgørende for at producere konsekvent reproducerbare optagelser. Det er vigtigt, at skruerne ikke er placeret for dybt til at inducere en læsion på hjernen. Knogle klap genvundet fra craniektomi af voksne (12 uger gamle) mandlige Wistar rotter er konsekvent 2 mm tyk. Brug EEG-elektrode skruer med en 2,5 mm aksel. Det er nyttigt at bruge spidsen af buede mygge hæmostatisk pincet som en spacer at sikre, at skruerne kun strækker sig til bunden af knoglen og ikke rager ind i hjernen.
Den fremgangsmåde, der præsenteres her, har nogle begrænsninger. Batterierne skal udskiftes med jævne mellemrum. Hyppigheden af batteriskift afhænger af samplingfrekvensen. Batterierne skiftes typisk en gang om ugen til en prøvetagnings hastighed på 1000 Hz. Denne tidsramme kan forlænges ved at reducere samplingfrekvensen. Systemet er også begrænset til optagelse fra fire monopolar EEG-elektroder. Men dette giver to kanaler pr. halvkugle og kan skelne mellem fokale og generaliserede begivenheder og kan skelne mellem forreste og posterior ændringer. På trods af disse begrænsninger giver denne fremgangsmåde en fornuftig metode til at gennemføre kontinuerlig video/EEG-overvågning og detektion af epileptiforme ændringer efter svær TBI.
Den metode, der er beskrevet her, resulterer i både elektro grafiske og krampeanfald inden for en måned efter TBI. Derfor giver denne fremgangsmåde en rimelig tidsramme til at studere potentielle behandlingsmetoder til forebyggelse af epileptogenesis efter svær TBI. Denne fremgangsmåde giver også en metode til at undersøge de molekylære mekanismer, der er forbundet med PTE, og kan føre til identificering af potentielle biomarkører, der kan bruges til at identificere patienter, der er mest udsatte for at udvikle PTE.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Paul Dressel for hans uvurderlige støtte i grafisk design og udarbejdelse af figurer.
1.00 mm Drill Bits | Drill Bit City: New Carbide Tools | 05M200 | |
3M ESPE Durelon Carboxylate Cement | 3M , Neuss Germany | 38019 | Dental Cement |
4-0 Suture | Ethicon, Sommerville, NJ | K831H | 4-0 Ethicon Perma-hand Silk, 26mm 1/2c Taperpoint, 30" (75cm), Black Braided non-absorbable suture |
5 mm outer diameter trephine | Fine Science Tools | 18004-50 | |
Bonewax | Medline Industries, Mendelcin, IL | REF DYNJBW25 | |
Buprenorphine HCL, Injection (0.3 mg/mL) 1 mL vial | Par Pharmalogical, Chestnut Ridge NY | 3003706 | NDC 42023-179-01 |
Dumont #6 Forceps | Fine Science Tools | 11260-20 | |
Dumont #7b Forceps | Fine Science Tools | 11270-20 | |
ecgAUTO | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Female Luer Thread Style Coupler Clear Polycarbonare | Cole-Palmer instrument | SKO#45501-22 | Order lot #214271 |
Foot Power Drill | Grobet USA, Carlstadt, NJ | Model C-300 | |
GentaMax 100 (Gentamicin, Sulfate Solution) | Phoenix, Manufactured by Clipper Distributing Company LLC, St. Joseph, MO | NDC 57319-520-05 | |
Hill's Prescription Diet a/d Canine/Feline | Hill's Pet Nutrition, Inc. , Topeka, KS | ||
IOX2 Software | EMKA Technologies, Falls Church, VA | ||
Isoflorane, USP | Piramal Enterprise Limited, Andhra, India | NDC 66794-013-25 | |
IsoTech Anesthesia machine | SurgiVet | WWV9000 | |
Lateral FPI device | AmScien | 302 | curved tip, with pressure tubing extension. connected via screw lock connector (Cole-Palmer; #4550-22) |
Leica A60 Stereomicroscope | Leica Biosystems, Richmond, VA | PN: 10 450 488 | |
Marcaine (0.5%) Bupivacaine hcl injection usp 5 mg/mL | Hospira, Lake Forest, IL | CA-3627 | 50mL multiple dose vial; NDC 0409-1610-50 |
Micro-Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | |
Olsen-Hegar Needle Holders with Suture Cutters | Fine Science Tools | 12002-14 | |
PALACOS R+G bone cement with gentamicin | Heraeus, | REF: 5036964 | Radiopaque bone cement containing 1 x 0.5g Gentamicin |
Physio Suite | Kent Scientific, Terrington, CT | ||
Povidone-iodine solution | Betadine | ||
Puralube Vet Ointment | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | NDC 17033-211-38 | |
Scalpel blade (#10) and holder | Integra Miltex, York, PA | REF: 4-110 | |
Scalpel Handle – #4 | Fine Science Tools | 10004-13 | |
Sickle Knife | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1705 HM | 5mm curved blade. Round handle. Overall length 168mm, 6.6 inches. |
Silverstein Micro Mirror | Bausch + Lomb Storz Instruments | N1706 S8 | 3mm diameter. Angled 45 degrees. Overall length 180mm, 7.2 inches |
Storage NAS | Synology Inc. | DS3615xs | |
Synology Assistant | Synology Inc. | ||
Thermal Cautery Unit | Geiger Medical Technology, Delasco Council Bluffs, IA | Model NO: 150 | |
Vetivex | Dechra Veterinary Products, Overland Park KS | Veterinary pHyLyteTM Injection pH 7.4 (Multiple Electrolytes Injection, Type 1, USP) | |
Video Cameras | TRENDnet, Torrance, CA | TV-IP314PI | Indoor/Outdoor 4MP H.265 WDR PoE IR Bullet Network Cameral |
Video NAS | Synology Inc. | DS916 | |
Wistar IGS rats | Charles River | strain code 003 | 12 wk old at the time of injury |
Wullstein Retractor | Fine Science Tools | 17018-11 |