Isolement et quantification du virus Zika à partir de plusieurs organes dans une souris
Summary
L’objectif du protocole est de démontrer les techniques utilisées pour étudier les maladies virales en isolant et en quantifiant le virus Zika, à partir de plusieurs organes d’une souris après l’infection.
Abstract
Les méthodes présentées démontrent les procédures de laboratoire pour l’isolement des organes des animaux infectés par le virus Zika et la quantification de la charge virale. Le but de la procédure est de quantifier les titreleurs viraux dans les zones périphériques et du SNC de la souris à différents moments après l’infection ou dans des conditions expérimentales différentes afin d’identifier les facteurs virologiques et immunologiques qui régulent l’infection par le virus Zika. Les procédures d’isolement d’organe démontrées permettent à la fois la formation de mise au point quantification et l’évaluation quantitative de PCR des titers viraux. Les techniques d’isolation rapide des organes sont conçues pour la préservation du téter antivirus. La quantification virale des titers par la mise au point de formation d’analyse permet l’évaluation rapide du débit du virus Zika. L’avantage de l’analyse de formation de mise au point est l’évaluation du virus infectieux, la limitation de cet analyse est le potentiel de toxicité des organes réduisant la limite de détection. L’évaluation virale de la térade est combinée avec le PCR quantitatif, et l’utilisation d’un numéro de copie virale recombinante de copie de copie de copie d’ARN dans l’organe est évaluée avec la limite basse de la détection. Dans l’ensemble, ces techniques fournissent une méthode de débit rapide précise pour l’analyse des titers viraux Zika dans la périphérie et le SNC des animaux infectés par le virus Zika et peuvent être appliquées à l’évaluation des titreleurs viraux dans les organes des animaux infectés par la plupart des pathogènes pathogènes, y compris le virus de la dengue.
Introduction
Le virus Zika (ZIKV) est un arbovirus qui appartient à la famille des flaviviridae, qui comprend d’importants pathogènes humains neuro-invasifs tels que le virus Powassan (POWV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV) et le virus du Nil occidental (VNO)1. Suite à son isolement et à son identification, il y a eu des rapports périodiques d’infections humaines de ZIKV en Afrique et en Asie2,3,4,5, et des épidémies en Amérique centrale et du Sud (revue en référence6). Cependant, ce n’est que récemment que le ZIKV a été pensé pour causer la maladie grave7. Maintenant, il ya des milliers de cas de maladies neurologiques et des malformations congénitales liées à des infections ZIKV. L’émergence rapide de ZIKV a suscité de nombreuses questions concernant: pourquoi il ya une augmentation de la gravité de la maladie, quelle est la réponse immunologique à l’infection ZIKV et y at-il des pathologies virales et / ou immunitaires à médiation liée à l’augmentation des troubles neurologiques manifestations et malformations congénitales. Il y a maintenant une ruée pour comprendre la maladie liée au système nerveux central (SNC) associée au ZIKV ainsi que la nécessité de tester rapidement l’efficacité des antiviraux et des vaccins contre le ZIKV. C’est dans ce contexte que nous avons développé des méthodes pour l’analyse rapide des titers ZIKV dans la périphérie et le SNC à l’aide d’un focus spécifique à ZIKV formant des essais (FFA).
Les modèles de petits animaux sont importants pour comprendre la progression de la maladie et pour l’évaluation précoce des vaccins, des traitements et des antiviraux. Nous avons établi de petits modèles animaux pour l’étude de la maladie d’arbovirus en utilisant diverses souches de souris pour modéliser l’infection humaine et la protection contre les agents pathogènes viraux8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. En utilisant cette expérience antérieure, nous avons commencé à modifier les techniques utilisées pour l’évaluation du VNO et du virus de la dengue, un flavivirus connexe pour l’évaluation de la ture ZIKV dans les deux organes périphériques ainsi que le CNS21,23, 24. Les avantages de ces méthodes par rapport à d’autres essais sont les : 1) qu’elles combinent la capacité de récolter des organes périphériques et du SNC pour l’analyse; 2) les méthodes sont adaptables pour la cytométrie de flux, pour des mesures des réponses immunitaires innées et adaptatives, avec des titers viraux sur le même animal dans le même organe ; 3) la technique de récolte est adaptable pour l’analyse histologique ; 4) le FFA de ZIKV est une méthode rapide de haut débit pour l’analyse virale de titer ; et 5) ces méthodes peuvent être appliquées à l’évaluation des titreleurs viraux dans les organes des animaux infectés par la plupart des agents pathogènes25.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’infection par le ZIKV peut causer une maladie neurologique, c’est pourquoi les modèles animaux actuels pour étudier la pathogénie, les réponses immunitaires et l’efficacité protectrice des vaccins et des antiviraux doivent se concentrer sur la lutte virale au sein du SNC. L’un des défis en se concentrant sur la maladie du SNC est qu’elle se fait souvent au détriment de l’étude de l’infection périphérique. Les méthodes d’isolement des organes proposées ici mettent l’accent sur la nécessité d’évaluer rapid…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Le Dr Pinto est financé par une subvention de démarrage de la Saint Louis University School of Medicine et des fonds de démarrage de l’École de médecine de l’Université Saint Louis. Le Dr Brien est financé par un prix K22AI104794 de l’INAID des NIH ainsi qu’une subvention de démarrage de l’École universitaire de Saint Louis. Pour toutes les personnes financées, les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle à jouer dans la conception des études, la collecte et l’analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Referências
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