Isolatie en kwantificering van het Zikavirus van meerdere organen in een muis
Summary
Het doel van het protocol is om de technieken aan te tonen die worden gebruikt om virale ziekten te onderzoeken door het Zikavirus te isoleren en te kwantificeren, van meerdere organen in een muis na infectie.
Abstract
De gepresenteerde methoden tonen laboratorium procedures voor de isolatie van organen van besmette dieren van het Zikavirus en de kwantificering van de virale belasting. Het doel van de procedure is het kwantificeren van virale Antilichaamtiters in perifere en CZS-gebieden van de muis op verschillende tijdstippen na infectie of onder verschillende experimentele omstandigheden om virologische en immunologische factoren te identificeren die de Zikavirus infectie reguleren. De orgel isolatie procedures laten zien dat zowel de bepaling van de focus vormende assay als de kwantitatieve PCR-beoordeling van virale titers mogelijk is. De snelle orgel isolatietechnieken zijn ontworpen voor het behoud van de virus titer. Virale titer kwantificering door focus vormende assay zorgt voor de snelle doorvoer beoordeling van het Zikavirus. Het voordeel van de focus vormende assay is de beoordeling van infectieuze virus, de beperking van deze test is het potentieel voor orgaantoxiciteit vermindering van de aantoonbaarheidsgrens. Virale titer beoordeling wordt gecombineerd met kwantitatieve PCR, en met behulp van een recombinant RNA kopie controle virale genoom kopie nummer binnen het orgel wordt beoordeeld met lage aantoonbaarheidsgrens. Over het algemeen bieden deze technieken een nauwkeurige snelle hoge doorvoer methode voor de analyse van Zika-virale Antilichaamtiters in de periferie en CNS van besmette dieren van het zikavirus en kunnen worden toegepast op de beoordeling van virale Antilichaamtiters in de organen van dieren die zijn geïnfecteerd met de meeste pathogenen, waaronder Denguevirus.
Introduction
Zika virus (zikv) is een Arbovirus dat behoort tot de familie van de virussen, die belangrijke neuroinvasieve menselijke pathogenen zoals Powassan virus (powv), Japanse encefalitis virus (JEV) en West Nile Virus (WNV)1bevat. Na de isolatie en identificatie zijn er periodieke meldingen geweest van menselijke zikv-infecties in Afrika en Azië2,3,4,5en epidemieën in Midden-en Zuid-Amerika (beoordeeld in Referentie6). Echter, het was niet tot voor kort dat ZIKV werd gedacht te veroorzaken ernstige ziekte7. Nu zijn er duizenden gevallen van neurologische aandoeningen en aangeboren afwijkingen gekoppeld aan ZIKV infecties. De snelle opkomst van ZIKV heeft veel vragen met betrekking tot: Waarom is er een toename van de ernst van de ziekte, wat is de immunologische respons op ZIKV infectie en zijn er virale en/of immuun gemedieerde pathologieën gekoppeld aan de toename van neurologische manifestaties en aangeboren afwijkingen. Er is nu een haast om te begrijpen het centraal zenuwstelsel (CNS) gerelateerde ziekte geassocieerd met ZIKV, alsmede de noodzaak om snel de werkzaamheid van de antivirale middelen en vaccins tegen ZIKV testen. Tegen deze achtergrond hebben we methoden ontwikkeld voor de snelle analyse van ZIKV-Antilichaamtiters in zowel de periferie als het CZS met behulp van een ZIKV-specifieke focus vormende assays (FFA).
Kleine diermodellen zijn belangrijk voor het begrijpen van ziekteprogressie en voor de vroege evaluatie van vaccins, Therapeutics en anti-Virals. We hebben kleine diermodellen vastgesteld voor de studie van de ziekte van Arbovirus door het gebruik van verschillende muis stammen om menselijke infectie te modelleren en bescherming tegen virale pathogenen8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20, 21,22. Met behulp van deze eerdere ervaring, begonnen we met het wijzigen van technieken die worden gebruikt voor de beoordeling van WNV en Denguevirus, een verwant Flavivirus voor de beoordeling van zikv titer in zowel perifere organen als de CNS21,23, 24. de voordelen van deze methoden ten opzichte van andere assays zijn: 1) dat zij het vermogen om zowel perifere als CNS organen te oogsten voor de analyse combineren; 2) de methoden zijn aanpasbaar voor flow cytometrie, voor metingen van aangeboren en adaptieve immuunresponsen, samen met virale Antilichaamtiters op hetzelfde dier in hetzelfde orgaan; 3) de oogsttechniek is aanpasbaar voor histologische analyse; 4) de ZIKV FFA is een snelle hoge doorvoer methode voor virale titer analyse; en 5) deze methoden kunnen worden toegepast op de beoordeling van virale Antilichaamtiters in de organen van dieren die besmet zijn met de meeste pathogenen25.
Protocol
Representative Results
Discussion
ZIKV infectie kan leiden tot een neurologische aandoening dus de huidige diermodellen om pathogenese te bestuderen, immuunresponsen en beschermende werkzaamheid van vaccins en antivirale middelen moeten zich richten op virale controle binnen het CZS. Een van de uitdagingen bij het concentreren op de ziekte van CNS is dat het vaak ten koste gaat van het bestuderen van perifere infectie. De orgel isolatie methoden die hier worden voorgesteld, zijn gericht op de noodzaak om de ZIKV-infectie in zowel de periferie als het CZS…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dr. Pinto wordt gefinancierd door een Seed Grant van de Saint Louis University School of Medicine en Startup funds van de Saint Louis University School of Medicine. Dr. Brien wordt gefinancierd door een K22AI104794 Early Investigator Award van de NIH NIAID en een Seed Grant van de University School van Saint Louis. Voor alle gefinancierde individuen hadden de financiers geen rol in studie ontwerp, gegevensverzameling en-analyse, besluit tot publicatie of voorbereiding van het manuscript.
Materials
| 1-bromo-3-chloropropane (BCP) | MRC gene | BP151 | |
| 10cc syringe | Thermo Fisher Scientific | BD 309642 | |
| 18G needle | Thermo Fisher Scientific | 22-557-145 | |
| 1cc TB syringe | Thermo Fisher Scientific | 14-823-16H | |
| 20cc syringe | Thermo Fisher Scientific | 05-561-66 | |
| 24 tube beadmill | Thermo Fisher Scientific | 15 340 163 | |
| 3.2 mm stainless steel beads | Thermo Fisher Scientific | NC9084634 | |
| 37C Tissue Culture incubator | Nuair | 5800 | |
| 4G2 antibody | in house | ||
| 96 well flat bottom plates | Midsci | TP92696 | |
| 96well round bottom plates | Midsci | TP92697 | |
| Basix 1.5ml eppendorf tubes | Thermo Fisher Scientific | 02-682-002 | |
| Concentrated Germicidal Bleach | Staples | 30966CT | |
| CTL S6 Analyzer | CTL | CTL S6 Universal Analyzer | |
| curved cutting scissors | Fine Science Tools | 14061-11 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium – high glucose With 4500 mg/L glucose | MilliporeSigma | D5671 | |
| Ethanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | e7023 | |
| Fetal Bovine Serum | MilliporeSigma | F0926-500ML | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11036-20 | |
| Glacial acetic acid | MilliporeSigma | 537020 | |
| Goat anti-mouse HRP-labeled antibody | MilliporeSigma | 8924 | |
| HEPES 1 M | MilliporeSigma | H3537-100ML | |
| Isopropanol (molecular biology-grade) | MilliporeSigma | I9516 | |
| Ketamine/Xylazine cocktail | Comparative Medicine | ||
| L-glutamine | MilliporeSigma | g7513 | |
| Magmax RNA purification kit | Thermo Fisher Scientific | AM1830 | |
| Methylcellulose | MilliporeSigma | M0512 | |
| Microcentrifuge | Ependorf | 5424R | |
| MiniCollect 0.5ml EDTA tubes | Bio-one | 450480 | |
| o-ring tubes | Thermo Fisher Scientific | 21-403-195 | |
| one step q RT-PCR mix | Thermo Fisher Scientific | 4392938 | |
| Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | EMS- 15713-S | |
| Phosphate Buffered Saline | MilliporeSigma | d8537-500ml | |
| Proline multichannel pipettes | Sartorius | 72230/72240 | |
| Proline single channel pipettes | Sartorius | 728230 | |
| RNAse free water | Thermo Fisher Scientific | 10-977-023 | |
| RNAzol BD | MRC gene | RB192 | |
| Rocking Platform | Thermo Fisher Scientific | 11-676-333 | |
| RPMI 1640 | Fisher | MT10040CV | |
| Saponin | MilliporeSigma | s7900 | |
| spoon/spatula | Fine Science Tools | 10090-17 | |
| straight cutting scissors | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| Triton X-100 | MilliporeSigma | t8787 | |
| True Blue Substrate | VWR | 95059-168 | |
| Trypsin | MilliporeSigma | T3924-100ML |
Referências
- Lazear, H. M., Diamond, M. S. Zika Virus: New Clinical Syndromes and Its Emergence in the Western Hemisphere. Journal of Virology. 90 (10), 4864-4875 (2016).
- Simpson, D. I. Zika Virus Infection in Man. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 58, 335-338 (1964).
- Fagbami, A. Epidemiological investigations on arbovirus infections at Igbo-Ora, Nigeria. Tropical and Geographical Medicine. 29 (2), 187-191 (1977).
- McCrae, A. W., Kirya, B. G. Yellow fever and Zika virus epizootics and enzootics in Uganda. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 76 (4), 552-562 (1982).
- Rodhain, F., et al. Arbovirus infections and viral haemorrhagic fevers in Uganda: a serological survey in Karamoja district, 1984. Transactions of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene. 83 (6), 851-854 (1984).
- Wikan, N., Smith, D. R. Zika virus: history of a newly emerging arbovirus. Lancet Infect Dis. 16 (7), e119-e126 (2016).
- . Zika virus outbreaks in the Americas. The Weekly Epidemiological Record. 90 (45), 609-610 (2015).
- Brien, J. D. . Immunological basis of age-related vulnerability to viral infection. , (2007).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Nikolich-Zugich, J. West Nile virus-specific CD4 T cells exhibit direct antiviral cytokine secretion and cytotoxicity and are sufficient for antiviral protection. Journal of Immunology. 181 (12), 8568-8575 (2008).
- Brien, J. D., Uhrlaub, J. L., Hirsch, A., Wiley, C. A., Nikolich-Zugich, J. Key role of T cell defects in age-related vulnerability to West Nile virus. Journal of Experimental Medicine. 206 (12), 2735-2745 (2009).
- Brien, J. D., et al. Genotype-specific neutralization and protection by antibodies against dengue virus type 3. Journal of Virology. 84 (20), 10630-10643 (2010).
- Shrestha, B., et al. The development of therapeutic antibodies that neutralize homologous and heterologous genotypes of dengue virus type 1. PLoS Pathogens. 6 (4), e1000823 (2010).
- Brien, J. D., et al. Interferon regulatory factor-1 (IRF-1) shapes both innate and CD8(+) T cell immune responses against West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (9), e1002230 (2011).
- Pinto, A. K., et al. A temporal role of type I interferon signaling in CD8+ T cell maturation during acute West Nile virus infection. PLoS Pathogens. 7 (12), e1002407 (2011).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Current Protocols in Microbiology. 31, 11-15 (2013).
- Brien, J. D., et al. Protection by immunoglobulin dual-affinity retargeting antibodies against dengue virus. Journal of Virology. 87 (13), 7747-7753 (2013).
- Messaoudi, I., et al. Chikungunya virus infection results in higher and persistent viral replication in aged rhesus macaques due to defects in anti-viral immunity. PLoS Neglected Tropical Diseases. 7 (7), e2343 (2013).
- Pinto, A. K., et al. A hydrogen peroxide-inactivated virus vaccine elicits humoral and cellular immunity and protects against lethal West Nile virus infection in aged mice. Journal of Virology. 87 (4), 1926-1936 (2013).
- Sukupolvi-Petty, S., et al. Functional analysis of antibodies against dengue virus type 4 reveals strain-dependent epitope exposure that impacts neutralization and protection. Journal of Virology. 87 (16), 8826-8842 (2013).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathogens. 10 (4), e1004086 (2014).
- Pinto, A. K., et al. Defining New Therapeutics Using a More Immunocompetent Mouse Model of Antibody-Enhanced Dengue Virus Infection. MBio. 6 (5), (2015).
- Pinto, A. K., et al. Human and Murine IFIT1 Proteins Do Not Restrict Infection of Negative-Sense RNA Viruses of the Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, and Filoviridae Families. Journal of Virology. 89 (18), 9465-9476 (2015).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathog. 14 (9), e1007237 (2018).
- Pinto, A. K., et al. Deficient IFN signaling by myeloid cells leads to MAVS-dependent virus-induced sepsis. PLoS Pathog. 10 (4), e1004086 (2014).
- Brien, J. D., Lazear, H. M., Diamond, M. S. Propagation, quantification, detection, and storage of West Nile virus. Curr Protoc Microbiol. 31, (2013).
- Hassert, M., et al. CD4+T cells mediate protection against Zika associated severe disease in a mouse model of infection. PLoS Pathogens. 14 (9), e1007237 (2018).
- Fuchs, A., Pinto, A. K., Schwaeble, W. J., Diamond, M. S. The lectin pathway of complement activation contributes to protection from West Nile virus infection. Virology. 412 (1), 101-109 (2011).
- Lazear, H. M., Pinto, A. K., Vogt, M. R., Gale, M., Diamond, M. S. Beta interferon controls West Nile virus infection and pathogenesis in mice. Journal of Virology. 85 (14), 7186-7194 (2011).
